CA2495291A1 - Forme galenique pour la delivrance colique de principes actifs - Google Patents
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Abstract
Formes galéniques multiparticulaires aptes à être utilisées par voie orale e t destinées à la délivrance colique de principes actifs choisis dans le groupe comprenant les enzymes capables d'inactiver les macrolides et apparentés, le s enzymes capables d'inactiver les quinolones et les .beta.-lactamases.</SDOAB >
Description
FORME GAI~ENIQUE POUR hA DEI~IVRANCE COLIQUE DE PRINCIPES
ACTIFS
La présente invention concerne une forme galénique à délivrance colïque, son procédé de préparation et son utilïsation en thérapeutique.
Les systèmes de libération spécifique au niveau du colon ont été reconnus comme présentant d'importants avantages thérapeutiques.
Un grand nombre de maladies coliques pourraient effectivement être traitées plus efficacement si le principe actif est libéré localement. C'est le cas, entre autres, de la maladie de Crohn, des colites ulcératives, du cancer colorectal et de la constipation.
Za libération colique pourrait aussi être intéressante quand, du point de vue thérapeutique., un retard à l'absorption est. nécessaire, notamment dans le traitement de pathologies comme l'asthme nocturne ou l'angor (Kinget R. et al. (1998), Colonic Drug Targeting, J~urnal o.f Drug Targeting, 6, 129) .
L'administration de princïpes actifs polypeptidiques se fait essentiellement par voie parentérale, qui est douloureuse et à l' origine d' une mauvaïse observance des traitements. Depuis quelques années, il y a donc un ïntérêt pour l'utilisation du colon comme site d'absorption des principes actifs peptidiques (analgésiques, contraceptifs, vaccins, insuline...).
L'absorption des peptides au niveau du colon semble effectivement meilleure qu'au niveau des autres sites du tube digestïf grâce, notamment, à une activité
protéolytique nettement plus faible qu'au niveau de
ACTIFS
La présente invention concerne une forme galénique à délivrance colïque, son procédé de préparation et son utilïsation en thérapeutique.
Les systèmes de libération spécifique au niveau du colon ont été reconnus comme présentant d'importants avantages thérapeutiques.
Un grand nombre de maladies coliques pourraient effectivement être traitées plus efficacement si le principe actif est libéré localement. C'est le cas, entre autres, de la maladie de Crohn, des colites ulcératives, du cancer colorectal et de la constipation.
Za libération colique pourrait aussi être intéressante quand, du point de vue thérapeutique., un retard à l'absorption est. nécessaire, notamment dans le traitement de pathologies comme l'asthme nocturne ou l'angor (Kinget R. et al. (1998), Colonic Drug Targeting, J~urnal o.f Drug Targeting, 6, 129) .
L'administration de princïpes actifs polypeptidiques se fait essentiellement par voie parentérale, qui est douloureuse et à l' origine d' une mauvaïse observance des traitements. Depuis quelques années, il y a donc un ïntérêt pour l'utilisation du colon comme site d'absorption des principes actifs peptidiques (analgésiques, contraceptifs, vaccins, insuline...).
L'absorption des peptides au niveau du colon semble effectivement meilleure qu'au niveau des autres sites du tube digestïf grâce, notamment, à une activité
protéolytique nettement plus faible qu'au niveau de
2 l'intestin grêle et à L'absence d'une activité
peptidasique associée à la membrane des cellules ëpithëliales coliques.
Lors de l'administration d'antibiotiques par la bouche, ceux-ci traversent l'estomac puïs sont absorbés au niveau de l'intestin grêle pour diffuser dans l'ensemble de l'organisme et traiter le foyer infectieux pour lequel ils ont été administrés. Toutefoïs, une fraction des antibïotiques ingérés (dont l'importance varie avec les caractéristiques propres de chaque type d'antibiotiques) n'est pas absorbée et continue sa progression jusqu'au colon avant d'être éliminée dans les selles. Ces antibiotiques résiduels sont rejoints, au nïveau de l'intestin grêle, par une fraction des antibiotiques absorbés mais qui sont rë-excrétés dans le tube digestif par l'intermédiaïre de l'élimination bïliaire. Cette fraction est d'importance variable en fonction du métabolisme et des voies d'élimination de chaque antibiotique. Enfin', pour certains antibiotiques, une fraction de la dose absorbée est élimïnée directement par la muqueuse intestinale dans la lumière du tube digestif. Ainsi, que les antibiotiques aient été
administrés par voie orale ou par voie parentérale, une fraction résiduelle active se retrouve généralement au niveau du colon. Cela est vrai, à des degrés divers, pour la grande majorité des familles d'antibiotiques utilisés en thérapeutique, la seule exception notable étant la famille des amino-glycosides pour lesquels l'excrétion intestinale est négligeable. Pour les autres antibiotiques, l'excrétion intestinale d'âne activité
antibiotique résiduelle va avoir différentes conséquences, toutes délétères. En effet, il exïste au
peptidasique associée à la membrane des cellules ëpithëliales coliques.
Lors de l'administration d'antibiotiques par la bouche, ceux-ci traversent l'estomac puïs sont absorbés au niveau de l'intestin grêle pour diffuser dans l'ensemble de l'organisme et traiter le foyer infectieux pour lequel ils ont été administrés. Toutefoïs, une fraction des antibïotiques ingérés (dont l'importance varie avec les caractéristiques propres de chaque type d'antibiotiques) n'est pas absorbée et continue sa progression jusqu'au colon avant d'être éliminée dans les selles. Ces antibiotiques résiduels sont rejoints, au nïveau de l'intestin grêle, par une fraction des antibiotiques absorbés mais qui sont rë-excrétés dans le tube digestif par l'intermédiaïre de l'élimination bïliaire. Cette fraction est d'importance variable en fonction du métabolisme et des voies d'élimination de chaque antibiotique. Enfin', pour certains antibiotiques, une fraction de la dose absorbée est élimïnée directement par la muqueuse intestinale dans la lumière du tube digestif. Ainsi, que les antibiotiques aient été
administrés par voie orale ou par voie parentérale, une fraction résiduelle active se retrouve généralement au niveau du colon. Cela est vrai, à des degrés divers, pour la grande majorité des familles d'antibiotiques utilisés en thérapeutique, la seule exception notable étant la famille des amino-glycosides pour lesquels l'excrétion intestinale est négligeable. Pour les autres antibiotiques, l'excrétion intestinale d'âne activité
antibiotique résiduelle va avoir différentes conséquences, toutes délétères. En effet, il exïste au
3 niveau du colon un écosystème bactérien complexe (plusieurs centaines d'espèces bactériennes différentes) et très dense (plus de 2011 bactëries par gramme de contenu colique) qui va être affecté par l'arrivée des résidus actifs d'antibiotiques. On pourra observer:
1) un déséquilibre de flore qui serait la cause principale des diarrhées banales suivant parfois la prise d'antibiotiques (Bartlett J.G. (2002) Clinical practice. Antibiotic associated diarrhea, New England Journal of Medicine, 346, 334). Bien que ces diarrhées ne soient en règle générale pas graves et cèdent rapidement, soit spontanément, soit à l'arrêt du traitement, elles sont toutefois mal ressenties par les patients et ajoutent à l'inconfort de la maladie de base pour laquelle l'antibiotïque a été
prescrit;
2) une perturbation des fonctions de résistance â la colonisation par des bactéries exogènes (ou "effet barrière") avec possibilités de risque accru d'infection, par exemple, intoxication alïmentaire à
salmonelle (Holmberg S.D. et al. (1984) Drug resistant Salmonella from animais fed antimicrobials, New En gland Journal of Medicine, 311, 61'~ ) ;
3) la sélection de micro-organismes résistants à
l'antïbiotique. Ces derniers peuvent être de divers types:
a) il peut d'abord s'agir de bactéries pathogènes comme par exemple,, Clostridium difficile, espèce capable de sécréter des toxines causant de redoutables colites dites pseudomembraneuses (Bartlett J.G. (1997) Clostridium difficile
1) un déséquilibre de flore qui serait la cause principale des diarrhées banales suivant parfois la prise d'antibiotiques (Bartlett J.G. (2002) Clinical practice. Antibiotic associated diarrhea, New England Journal of Medicine, 346, 334). Bien que ces diarrhées ne soient en règle générale pas graves et cèdent rapidement, soit spontanément, soit à l'arrêt du traitement, elles sont toutefois mal ressenties par les patients et ajoutent à l'inconfort de la maladie de base pour laquelle l'antibiotïque a été
prescrit;
2) une perturbation des fonctions de résistance â la colonisation par des bactéries exogènes (ou "effet barrière") avec possibilités de risque accru d'infection, par exemple, intoxication alïmentaire à
salmonelle (Holmberg S.D. et al. (1984) Drug resistant Salmonella from animais fed antimicrobials, New En gland Journal of Medicine, 311, 61'~ ) ;
3) la sélection de micro-organismes résistants à
l'antïbiotique. Ces derniers peuvent être de divers types:
a) il peut d'abord s'agir de bactéries pathogènes comme par exemple,, Clostridium difficile, espèce capable de sécréter des toxines causant de redoutables colites dites pseudomembraneuses (Bartlett J.G. (1997) Clostridium difficile
4 infection: pathophysïology and diagnosis, Seminar in Gastrointestinal Disease, 8, 12);
b) il peut aussi s'agir de microorganismes relativement peu pathogènes mais dont la multiplication peut amener à une infection de voisinage jCanc~idose vaginale ou cystite à
Escherichia soli résistant).
c) I1 peut enfin s'agir de bactéries résistantes commensales non pathogènes mais dont la multiplication et l'élimination fécale va accroître la dissémination dans l'environnement. Or, ees bactéries commensales résistantes peuvent constituer une source importante de mécanismes de rési stance pour des espèces pathogènes. Ce risque est actuellement considéré comme majeur en raison du caractère inquiétant de l'évolution vers la multirésistance de nombreuses espèces pathogènes pour l'homme.
De nombreuses stratégies exploitant les divers paramètres physiologiques du tube digestif ont donc été
envisagées dans le .but de libérer des principes actifs au niveau du colon. Des études ont notamment été réalisées à
l'aide de systèmes d'administration laasés sur (1) l'utilisation de polymères sensibles aux variations de pH, (2) de formes à libération dépendante du temps, (3) de prodrogues ou encore de .polymères dégradables par les bactéries de la flore.
(1) Zes systèmes basés sur les variations de pH.
Le pH au niveau de l'estomac est de l'ordre de 1 à 3 mais il augmente dans l'intestin grêle et le colon pour atteindre des valeurs voisines de 7 (Hovgaard Z. et a1.
(1996) Current Applications of Polysaccharides in Colon fargeting, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 13, 185). Pour qu'un principe actif atteigne le colon, sans subir ces variations de pH, il est possible
b) il peut aussi s'agir de microorganismes relativement peu pathogènes mais dont la multiplication peut amener à une infection de voisinage jCanc~idose vaginale ou cystite à
Escherichia soli résistant).
c) I1 peut enfin s'agir de bactéries résistantes commensales non pathogènes mais dont la multiplication et l'élimination fécale va accroître la dissémination dans l'environnement. Or, ees bactéries commensales résistantes peuvent constituer une source importante de mécanismes de rési stance pour des espèces pathogènes. Ce risque est actuellement considéré comme majeur en raison du caractère inquiétant de l'évolution vers la multirésistance de nombreuses espèces pathogènes pour l'homme.
De nombreuses stratégies exploitant les divers paramètres physiologiques du tube digestif ont donc été
envisagées dans le .but de libérer des principes actifs au niveau du colon. Des études ont notamment été réalisées à
l'aide de systèmes d'administration laasés sur (1) l'utilisation de polymères sensibles aux variations de pH, (2) de formes à libération dépendante du temps, (3) de prodrogues ou encore de .polymères dégradables par les bactéries de la flore.
(1) Zes systèmes basés sur les variations de pH.
Le pH au niveau de l'estomac est de l'ordre de 1 à 3 mais il augmente dans l'intestin grêle et le colon pour atteindre des valeurs voisines de 7 (Hovgaard Z. et a1.
(1996) Current Applications of Polysaccharides in Colon fargeting, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 13, 185). Pour qu'un principe actif atteigne le colon, sans subir ces variations de pH, il est possible
5 de l'administrer sous forme de comprimés, de gélules ou de sphéroïdes enrobés avec un polymère pH dépendant, insoluble à pH acide mais soluble à des pH neutres ou alcalins (Kinget et al. déjà cité). Les polymères les plus couramment utilisés sont des dérivés de l'acide mëthacrylique, les Eudragit" L et S (Ashford M. et al.
(1993), An in vivo investigation into the suitability of pH-dependent polymers for colonie targeting, International Journal of Pharmaceutics, 95, 193 et 95, 241 et David A. et a1. (1997) Acrylic polymers f-or colon-specific drug delivery, S.T.P. Pharma Sciences, 7, 546) .
Etant donné l'importante variabilité inter- et intra-ïndividuelle des valeurs de pH existant au niveau du tractus gastro-intestinal, les polymères pH dépendants ne représentent pas le meilleur moyen pour obtenir une libération spécifique au niveau du colon (Ashford M. et al . , déj à cité) .
(2) Les systèmes basés sur le temps de transit.
La formulation de ces systèmes est telle qu'elle permet une libërat.ion des principes actifs après un laps de temps prédéfini. Afin de libérer le principe actif au niveau du colon, ces formes doivent à la fois résister à
l'environnement acide de l'estomac et entrer dans une phase silencieuse d'un temps prédéterminé, avant de libérer le principe actif, correspondant au temps de transit de la bouche à l'iléon terminal (Ga~zaniga A, e.t
(1993), An in vivo investigation into the suitability of pH-dependent polymers for colonie targeting, International Journal of Pharmaceutics, 95, 193 et 95, 241 et David A. et a1. (1997) Acrylic polymers f-or colon-specific drug delivery, S.T.P. Pharma Sciences, 7, 546) .
Etant donné l'importante variabilité inter- et intra-ïndividuelle des valeurs de pH existant au niveau du tractus gastro-intestinal, les polymères pH dépendants ne représentent pas le meilleur moyen pour obtenir une libération spécifique au niveau du colon (Ashford M. et al . , déj à cité) .
(2) Les systèmes basés sur le temps de transit.
La formulation de ces systèmes est telle qu'elle permet une libërat.ion des principes actifs après un laps de temps prédéfini. Afin de libérer le principe actif au niveau du colon, ces formes doivent à la fois résister à
l'environnement acide de l'estomac et entrer dans une phase silencieuse d'un temps prédéterminé, avant de libérer le principe actif, correspondant au temps de transit de la bouche à l'iléon terminal (Ga~zaniga A, e.t
6 a1. (1995) Time-dependent oral delivery systems for colon targeting, S.T.P.Pharma Sciences, 5, 83 et 108, 77; Ziu P. et a1. (1999) Alginate/Pectïn/Poly-Z-lysine particulate as a potential controlled release formulation, J. Pharm. Pharmacol. , 51, 141; Pozzi F. et al .
(1994) The Time Clock system: a new oral dosage form for fast and complete release of drug after predetermined lag Lime, Journal of Controlled Release, 31, 99).
La Pulsincap° de Scherer fut parmi les premières formulations de ce type (demande internationale WO 90/09,168). Elle a l'apparence d'une gélule dont le corps est insoluble dans l'eau. Le principe actif est maintenu dans le corps par un bouchon d'hydrogel placé au niveau de la tête de la gélule hydrosoluble. Le tout est enrobé d'un film gastro-résistant. Après dissolution de la tête au niveau de l'intestin grêle, le bouchon, au contact des liquides digestifs, gonfle. quand ce dernier atteint un seuil de gonflement critique il est éjecté, permettant ainsi la libération du principe actif. Le temps d'éjection est contrôlé par les propriétés de l'hydrogel composant le bouchon.
Les systèmes basés sur le temps de transit présentent toutefois de nombreux inconvénients (variabilités des temps de vidange gastrique et de transit, phénomènes de rétention au niveau de la valvule iléo-caecale (Kinget R., déjà cité), leur procurant un manque de spécificité
et empêchant d'aboutir à une validation de ces derniers comme systèmes de libération spécifique au niveau du colon. Enfin la production à large échelle de ce type de systèmes est difficilement envisageable car elle nécessiterait une adaptation importante et coûteuse des technologies industrielles.
(1994) The Time Clock system: a new oral dosage form for fast and complete release of drug after predetermined lag Lime, Journal of Controlled Release, 31, 99).
La Pulsincap° de Scherer fut parmi les premières formulations de ce type (demande internationale WO 90/09,168). Elle a l'apparence d'une gélule dont le corps est insoluble dans l'eau. Le principe actif est maintenu dans le corps par un bouchon d'hydrogel placé au niveau de la tête de la gélule hydrosoluble. Le tout est enrobé d'un film gastro-résistant. Après dissolution de la tête au niveau de l'intestin grêle, le bouchon, au contact des liquides digestifs, gonfle. quand ce dernier atteint un seuil de gonflement critique il est éjecté, permettant ainsi la libération du principe actif. Le temps d'éjection est contrôlé par les propriétés de l'hydrogel composant le bouchon.
Les systèmes basés sur le temps de transit présentent toutefois de nombreux inconvénients (variabilités des temps de vidange gastrique et de transit, phénomènes de rétention au niveau de la valvule iléo-caecale (Kinget R., déjà cité), leur procurant un manque de spécificité
et empêchant d'aboutir à une validation de ces derniers comme systèmes de libération spécifique au niveau du colon. Enfin la production à large échelle de ce type de systèmes est difficilement envisageable car elle nécessiterait une adaptation importante et coûteuse des technologies industrielles.
7 Récemment une nouvelle forme pour le ciblage colique a été développée, la "Colon-targeted Delivery Capsule"
(CTDC) (Ishibashi T. et a1. (1998) Design and evaluatïon of a new capsule-type dosage form for colon-targeted delivery of drugs, Internatïonal Journal of Pharmaceuties, 168, 31 et 57, 45). La CTDC est un système associant à la fois le facteur pH-dépendant et le facteur temps-dépendant. Il se présente sous la forme d'une gélule classique renfermant le principe actif et un acide l0 organique (acide succinique), recouverte de 3 couches.
(3) Les systêmes basés sur l'activité enzymatique de la flore microbienne colique.
3.1. Les prodrogues.
Les prodrogues ont largement été étudiées pour le ciblage colique de principes actifs divers (antz-inflammatoires non stéroï.diens et stéroïdiens, spasmolytiques,..). Ces systèmes sont basés sur la capacité
qu'ont les enzymes produites par la flore colique de dégrader les prodrogues afin de lïbérer 1a forme active du principe actif.
De nombreuses prodrogues basées sur l'action des azoréductases bactériennes ont notamment été développées dans le büt de libérer au niveau du colon, des principes actifs tels que l'acïde 5-aminosalicylique (5-ASA) utilisé dans le traitement de pathologies locales comme la maladie de Crohn ou les colites ulcératives (Peppercorn M.A. et al. (1972) The yole of intestinal bacteria in the metabolïsm of salicylazosulfapyridine, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 181, 555 et 64, 240).
(CTDC) (Ishibashi T. et a1. (1998) Design and evaluatïon of a new capsule-type dosage form for colon-targeted delivery of drugs, Internatïonal Journal of Pharmaceuties, 168, 31 et 57, 45). La CTDC est un système associant à la fois le facteur pH-dépendant et le facteur temps-dépendant. Il se présente sous la forme d'une gélule classique renfermant le principe actif et un acide l0 organique (acide succinique), recouverte de 3 couches.
(3) Les systêmes basés sur l'activité enzymatique de la flore microbienne colique.
3.1. Les prodrogues.
Les prodrogues ont largement été étudiées pour le ciblage colique de principes actifs divers (antz-inflammatoires non stéroï.diens et stéroïdiens, spasmolytiques,..). Ces systèmes sont basés sur la capacité
qu'ont les enzymes produites par la flore colique de dégrader les prodrogues afin de lïbérer 1a forme active du principe actif.
De nombreuses prodrogues basées sur l'action des azoréductases bactériennes ont notamment été développées dans le büt de libérer au niveau du colon, des principes actifs tels que l'acïde 5-aminosalicylique (5-ASA) utilisé dans le traitement de pathologies locales comme la maladie de Crohn ou les colites ulcératives (Peppercorn M.A. et al. (1972) The yole of intestinal bacteria in the metabolïsm of salicylazosulfapyridine, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 181, 555 et 64, 240).
8 PCT/FR2003/002474 Une autre approche consiste à exploiter les hydrolases bactériennes comme les glycosidases et les polysaccharidases (Friend D.R. (1995) Glycoside prodrugs;
novel pharmacotherapy for colonie diseases, ,S.T.P.Pharma Sciences, 5, 70~ Friend D.R. et a1. (1984) A colon-specific drug-delivery system based on drug glycosides and the glycosidases of colonie bacteria,, Journal of Medicinal Chemistry, 27, 261; Friend D.R. et a1. (1985) Drug glycosides: potential prodrugs for colon-specific drug delivery, Journal of Medicinal Chemistry, 28, 51; et Friend 'D. R. et a1. (1992) Drug glycosides in oral colon-specific drug delivery, Journal of Controlled Release, 19, 109). Des prodrogues ont ainsi ëté dëveloppées en couplant, par exemple, des stéroïdes à des sucres (glucose,, galactose, cellobiose, dextrane (demande internationale WO 90/09168)),, cyclodextrines (Hirayama F.
et al. (1996) In vitro evaluation of Biphenylyl Acetïc Acid-,(3-Cyclodextrin conjugates as colon-targeting prodrugs: drug release behavior in rat biological media, Journal of.Pharmacy and Pharmacology, 48, 27).
3.2. L'enrobage par des polymères biodégradables par les enzymes bactériennes.
Dans ce cas, 1e ciblage colique se fait par enrobage de la forme pharmaceutique avec un polymère spécifiquement dégradé par les enzymes produites par .la microflore, en mettant à profit la prësence des azorëductases ou des glycosidases bactériennes.
De nombreux polymères renfermant des liaisons azoaromatiques ont été utïli.sés pour enrober un principe actif. Saffran et al. (Oral insulin in diabetic dogs, Journal of Endocrinology (1991),, 131, 267 et A new
novel pharmacotherapy for colonie diseases, ,S.T.P.Pharma Sciences, 5, 70~ Friend D.R. et a1. (1984) A colon-specific drug-delivery system based on drug glycosides and the glycosidases of colonie bacteria,, Journal of Medicinal Chemistry, 27, 261; Friend D.R. et a1. (1985) Drug glycosides: potential prodrugs for colon-specific drug delivery, Journal of Medicinal Chemistry, 28, 51; et Friend 'D. R. et a1. (1992) Drug glycosides in oral colon-specific drug delivery, Journal of Controlled Release, 19, 109). Des prodrogues ont ainsi ëté dëveloppées en couplant, par exemple, des stéroïdes à des sucres (glucose,, galactose, cellobiose, dextrane (demande internationale WO 90/09168)),, cyclodextrines (Hirayama F.
et al. (1996) In vitro evaluation of Biphenylyl Acetïc Acid-,(3-Cyclodextrin conjugates as colon-targeting prodrugs: drug release behavior in rat biological media, Journal of.Pharmacy and Pharmacology, 48, 27).
3.2. L'enrobage par des polymères biodégradables par les enzymes bactériennes.
Dans ce cas, 1e ciblage colique se fait par enrobage de la forme pharmaceutique avec un polymère spécifiquement dégradé par les enzymes produites par .la microflore, en mettant à profit la prësence des azorëductases ou des glycosidases bactériennes.
De nombreux polymères renfermant des liaisons azoaromatiques ont été utïli.sés pour enrober un principe actif. Saffran et al. (Oral insulin in diabetic dogs, Journal of Endocrinology (1991),, 131, 267 et A new
9 approach to the oral administration of insulin and other peptide drugs, Science (1986), 233, 1081) ont ainsi décrit la libération d'insuline et de vasopressine dans le colon de rats et de chiens à partir de formes orales enrobées avec des copolymères de styrène et d'hydroxyéthylméthacrylate (HEMA) reliés par des lïaisons azoaromatiques. Cet enrobage est dégradé dans le colon par les azoréductases bactériennes entraînant ainsi la libération de la substance active.
L'avantage des azopolymères est qu'ils permettent une très bonne sélectivité colique pour la libération de principes actifs. d'inconvénient lié à leur utilisation est le manque de connaissances sur leur éventuelle toxicité.
Pour éviter cet inconvénient, d'autres études se sont plutôt portées sur l'utïlisation de film d'enrobage à
base de substances naturelles comme les polysaccharides avec notamment des films d'enrobage à base d'amylose/éthylcellulose (Mïlojevic S. et a1. (1996) Amylose as a coating for drug delivery to the colon:
preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of C'ont.rolled Release, 38, 75), à base d'un ester de dex'trane (Bauer K.H. et al. (1995) Novel pharmaceutical excipients for colon targeting, S.T.P.Pharma Sciences, 5, 54) ou de pectine.
3.3. Zes matrices biodégradables par les enzymes bactériennes.
Une autre approche de systèmes à libération spécifique au niveau du colon consiste en l'élaboration de matrices par compression d'un mélange de principe actif et de polymères biodégradables comme la chondroïtine sulfate (Rubinsteïn A. et al. (1992b) Chondroitin sulfate: a potential biodegradable carrier for colon-specific drug delivery, International Journal 5 of Pharmaceutics, 84, 141 et Rubinstein A. et al. (1992a) Colonic drug delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin matrix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, 9, 276) , la gomme guar (Krishnaiah Y.S.R. et al. (1998) Évaluation of guar gum
L'avantage des azopolymères est qu'ils permettent une très bonne sélectivité colique pour la libération de principes actifs. d'inconvénient lié à leur utilisation est le manque de connaissances sur leur éventuelle toxicité.
Pour éviter cet inconvénient, d'autres études se sont plutôt portées sur l'utïlisation de film d'enrobage à
base de substances naturelles comme les polysaccharides avec notamment des films d'enrobage à base d'amylose/éthylcellulose (Mïlojevic S. et a1. (1996) Amylose as a coating for drug delivery to the colon:
preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of C'ont.rolled Release, 38, 75), à base d'un ester de dex'trane (Bauer K.H. et al. (1995) Novel pharmaceutical excipients for colon targeting, S.T.P.Pharma Sciences, 5, 54) ou de pectine.
3.3. Zes matrices biodégradables par les enzymes bactériennes.
Une autre approche de systèmes à libération spécifique au niveau du colon consiste en l'élaboration de matrices par compression d'un mélange de principe actif et de polymères biodégradables comme la chondroïtine sulfate (Rubinsteïn A. et al. (1992b) Chondroitin sulfate: a potential biodegradable carrier for colon-specific drug delivery, International Journal 5 of Pharmaceutics, 84, 141 et Rubinstein A. et al. (1992a) Colonic drug delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin matrix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, 9, 276) , la gomme guar (Krishnaiah Y.S.R. et al. (1998) Évaluation of guar gum
10 as a compression coat for drug targeting to colon, International Journal of Pharmaceutics, 171, 137), le chitosan (Tozaki H. et a1. (1997) Chitosan capsules for colon-specïfic drug delivery: 'improvement of insulin absorption from the rat colon, Journal of Pharmaceutical Sciences, 86, 1016) ou la pectine (Rubinstein A. et al.
(1993) In vitro evaluation of calcïum pectinate: a potential colon-specific drug delivery carrier, Pharmaceutical Research, 10, 258).
Zes systèmes basés sur l'activité enzymatique de la flore microbienne sont probablement ceux présentant le plus de spécificité colique pour la libération des principes actifs. Ils constituent donc une voie d'avenir pour le ciblage colique.
L'intérêt des polysaccharides dans la préparation de systèmes pour administration colique réside dans le fait qu'ils sont d'origine naturelle, faiblement toxiques et spécifiquement dégradées par les enzymes bactériennes de la flore colique.
Ainsi, la pectine est un polysaccharide ïsolé des parois cellulaires des végétaux supérieurs, largement utilisé dans l'industrie agro-alimentaire (comme gélifiant ou épaississant de confitures, glaces...) et
(1993) In vitro evaluation of calcïum pectinate: a potential colon-specific drug delivery carrier, Pharmaceutical Research, 10, 258).
Zes systèmes basés sur l'activité enzymatique de la flore microbienne sont probablement ceux présentant le plus de spécificité colique pour la libération des principes actifs. Ils constituent donc une voie d'avenir pour le ciblage colique.
L'intérêt des polysaccharides dans la préparation de systèmes pour administration colique réside dans le fait qu'ils sont d'origine naturelle, faiblement toxiques et spécifiquement dégradées par les enzymes bactériennes de la flore colique.
Ainsi, la pectine est un polysaccharide ïsolé des parois cellulaires des végétaux supérieurs, largement utilisé dans l'industrie agro-alimentaire (comme gélifiant ou épaississant de confitures, glaces...) et
11 pharmaceutique. Elle est polymoléculaïre et polydïsperse.
Sa composition varie selon la source, les conditions d'extraction et les facteurs environnementaux.
Les pectines sont principalement composées d'enchaînements linéaires d'acides a-1,4-(D) galacturoniques, parfois entrecoupés par des unités de rhamnose. Les groupements carboxyliques des acides galacturoniques peuvent être partiellement estérifiés pour donner des pectines méthylées. On distingue deux sortes de pectine selon leur degré de méthylation (DM:
nombre de groupement méthoxy- pour 100 unités d'acide galacturonique):
- la pectine hautement méthylée (HM: hïgh methoxy) dont le degré de méthylation varie entre 50 et 80~.
Elle est peu soluble dans l'eau et forme des gels en milieu acide (pH<3,6) ou en présence de sucres;
- la pectine faiblement méthylée (LM: low methoxy), avec un degré de méthylation allant de 25 a 50~.
Plus soluble dans l'eau que 1a pectine HM, elle donne des gels en présence de cations divalents comme les ions Ca2+. En effet, les ions Ca2+ forment des "ponts" entre les groupements carboxyles libres des acides galacturoniques. Ze réseau ainsi formë a été décrit par tirant et al. sous le nom de «egg-box modal» (tirant G.T. et al. (1973) Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box modal, FEBS Zetters, 32, 195).
Il existe aussi des pectines amidées. Par traitement de la pectine par l'ammoniaque certains groupements carboxylate de méthyle (-COOCH~) peuvent -être transformés en groupements carboxamides (-CONH2). Cette amidatzon
Sa composition varie selon la source, les conditions d'extraction et les facteurs environnementaux.
Les pectines sont principalement composées d'enchaînements linéaires d'acides a-1,4-(D) galacturoniques, parfois entrecoupés par des unités de rhamnose. Les groupements carboxyliques des acides galacturoniques peuvent être partiellement estérifiés pour donner des pectines méthylées. On distingue deux sortes de pectine selon leur degré de méthylation (DM:
nombre de groupement méthoxy- pour 100 unités d'acide galacturonique):
- la pectine hautement méthylée (HM: hïgh methoxy) dont le degré de méthylation varie entre 50 et 80~.
Elle est peu soluble dans l'eau et forme des gels en milieu acide (pH<3,6) ou en présence de sucres;
- la pectine faiblement méthylée (LM: low methoxy), avec un degré de méthylation allant de 25 a 50~.
Plus soluble dans l'eau que 1a pectine HM, elle donne des gels en présence de cations divalents comme les ions Ca2+. En effet, les ions Ca2+ forment des "ponts" entre les groupements carboxyles libres des acides galacturoniques. Ze réseau ainsi formë a été décrit par tirant et al. sous le nom de «egg-box modal» (tirant G.T. et al. (1973) Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box modal, FEBS Zetters, 32, 195).
Il existe aussi des pectines amidées. Par traitement de la pectine par l'ammoniaque certains groupements carboxylate de méthyle (-COOCH~) peuvent -être transformés en groupements carboxamides (-CONH2). Cette amidatzon
12 confère de nouvelles propriétés aux pectines, notamment une meilleure résistance aux variations de pH.
Za pectine est dégradée par des enzymes issues de végétaux supérieurs et de divers microorganismes (champignons, bactéries...) parmi lesquels on retrouve les bactéries de la flore colique humaine. Les enzymes produites par la microflore sont composées d'un ensemble de polysaccharidases, de glycosidases et d'estérases.
L'enrobage d'une forme galénique par la pectine s'effectue soit par compressïon (Ashford M. et al.
(1993b), An evaluation of pectin as a carrier for drag targeting to the colon, Journal of Controlled Release, 2~, 213), soit par pulvérisation. L'enrobage par compression est génégalement réalisé avec de la pectine seule alors que celui par pulvérisation nécessite l'emploi d'un polymère filmogène en plus de la pectine (Milojevic S. et al. (1996) Amylose as a coating for drag delivery to the colon: preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of Controlled Release, 38, 75; Wakerly 2. et al. (1996) Pectin/ethycellulose film coating formulations for colonic drag delivery, Pharmaceutical Research, 13, 1210 ) .
De nombreuses formes matricielles à base de pectine ont également été étudiées. 'Elles sont généralement constituées soit de pectine pure, soit de son complexe avec les .ions Ca2+, faiblement hydrosoluble, le pectinate de calcium. Une matrice de pectinate de calcium renfermant de l'indomëtacine a .notamment ëtë décrite par Rubinstein et al. (1992a) Colonie drag delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin ma'trix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, :9,
Za pectine est dégradée par des enzymes issues de végétaux supérieurs et de divers microorganismes (champignons, bactéries...) parmi lesquels on retrouve les bactéries de la flore colique humaine. Les enzymes produites par la microflore sont composées d'un ensemble de polysaccharidases, de glycosidases et d'estérases.
L'enrobage d'une forme galénique par la pectine s'effectue soit par compressïon (Ashford M. et al.
(1993b), An evaluation of pectin as a carrier for drag targeting to the colon, Journal of Controlled Release, 2~, 213), soit par pulvérisation. L'enrobage par compression est génégalement réalisé avec de la pectine seule alors que celui par pulvérisation nécessite l'emploi d'un polymère filmogène en plus de la pectine (Milojevic S. et al. (1996) Amylose as a coating for drag delivery to the colon: preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of Controlled Release, 38, 75; Wakerly 2. et al. (1996) Pectin/ethycellulose film coating formulations for colonic drag delivery, Pharmaceutical Research, 13, 1210 ) .
De nombreuses formes matricielles à base de pectine ont également été étudiées. 'Elles sont généralement constituées soit de pectine pure, soit de son complexe avec les .ions Ca2+, faiblement hydrosoluble, le pectinate de calcium. Une matrice de pectinate de calcium renfermant de l'indomëtacine a .notamment ëtë décrite par Rubinstein et al. (1992a) Colonie drag delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin ma'trix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, :9,
13 276) montrant une meilleure stabilité du pectinate de calcium que la pectine seule dans les milieux digestifs, tout en restant sensible à l'action des enzymes pectinolytiques.
Les pectines amidées, plus tolérantes aux variations de pH ont aussi été étudiées pour l'élaboration de comprimés matriciels à visée colique (Wakerly Z. et al.
(1997) Studies on amidated pectins as potentiel carriers in colonie drug delivery, Journal of Pharmacy and Pharmacologyl. 49, 622).
Aydin et al. ((1996) Preparatïon and evaluation of pectïn beads, International Journal of Pharmaceutïcs, 137, 133) ont été les premiers à formuler des billes de pectine selon la méthode de gélification ionique de Bodmeier et al. ((1989) Preparation and evaluation of drug-containing chitosan beads, Drug Development and Industriel Pharmacy, 15, 1475 et Spherical agglomerates of water-insoluble drugs, Journal of Pharmaceutical Sciences, 78, 964) qui avait mis au point des billes d'alginate et de chïtosane. Leur objectif était d'incorporer dans les billes deux principes actifs différents, un cationique (l'aténolol) et un anionique (le pïroxicam)., afin de caractériser d'éventuelles interactions avec la pectine. Ils ont ainsi montré qu'il était possible de former des billes avec les 2 types de principe actifs et que les conditions opératoires avaient une influence capitale sur les propriétés des billes obtenues.
Sriamornsak s'est servi de billes de pectinate de calcium afin d'établir un système pour la lï'bération spécifique de protéines au niveau du colon, en utilisant la serum albumine bovine (BSA) d'un poids moléculaire de
Les pectines amidées, plus tolérantes aux variations de pH ont aussi été étudiées pour l'élaboration de comprimés matriciels à visée colique (Wakerly Z. et al.
(1997) Studies on amidated pectins as potentiel carriers in colonie drug delivery, Journal of Pharmacy and Pharmacologyl. 49, 622).
Aydin et al. ((1996) Preparatïon and evaluation of pectïn beads, International Journal of Pharmaceutïcs, 137, 133) ont été les premiers à formuler des billes de pectine selon la méthode de gélification ionique de Bodmeier et al. ((1989) Preparation and evaluation of drug-containing chitosan beads, Drug Development and Industriel Pharmacy, 15, 1475 et Spherical agglomerates of water-insoluble drugs, Journal of Pharmaceutical Sciences, 78, 964) qui avait mis au point des billes d'alginate et de chïtosane. Leur objectif était d'incorporer dans les billes deux principes actifs différents, un cationique (l'aténolol) et un anionique (le pïroxicam)., afin de caractériser d'éventuelles interactions avec la pectine. Ils ont ainsi montré qu'il était possible de former des billes avec les 2 types de principe actifs et que les conditions opératoires avaient une influence capitale sur les propriétés des billes obtenues.
Sriamornsak s'est servi de billes de pectinate de calcium afin d'établir un système pour la lï'bération spécifique de protéines au niveau du colon, en utilisant la serum albumine bovine (BSA) d'un poids moléculaire de
14 66400 Da. comme protéine modèle (Sriamornsak P. (1998) Investïgation on pectin as a carrier for oral delivery of proteins using calcium pectinate gel beads, International Journal of Pharmaceutics, 169, 213 et (1999) Effect of S calcium concentratïon, hardening agent and drying condition on release characteristics of oral proteins from calcium pectinate gel beads, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 8, 221). Il a étudié l'influence de différents facteurs de formulation sur les propriétés des billes obtenues comme leur forme, leur taille, le taux d'encapsulation de la BSA et sa cinétique de libération. Sriamornsak a donc démontré que les billes de pectinate de Ca pourraient être employées pour 1a libération spécïfique de ,protëïnes au niveau du colon.
L'obtention d'un profil de cinétique de libération adéquat dépend principalement du choix de la formulatïon et des conditïons opératoires pour la préparation des billes. Aucune corrélation in vitro/in vivo des profils de libération des principes actifs encapsulées n'a été
établie.
Afin d'augmenter la stabilité des particules le long du tractus digestif et d'éviter toute libération prématurée du principe actif encapsulé, il est possible de renforcer les billes de pectïne en les réticulant avec un polymère cationique.
Munjeri et al. ((1997) Hydrogel beads based on amidated pectins for colon-specific drag delïvery: the vole of chitosan in modifying drag release, Journal of Controlled Release, 46, 273) ont réticulé des billes de pectine amidée avec du chitosane. Ils ont alors montré, en comparant les cinétiques de dissolution de formes réticulées et de formes non réticulées, que le chitosane l5 permettait de minimiser la libération des principes actifs insolubles mais ne modifïait pas signïficativement la libération des principes actïfs hydrosolubles. La perte de principe actif dans des conditions mimant celles de l'estomac et de l'intestin grêle peut donc être limitée par la formation d'un complexe entre le chitosane et la pectine amidëe; les billes de pectine rëticulëes restant toujours sensibles à l'action des enzymes pectinolytiques coliques.
Un autre agent rëticulant, 1a polylysine, a étë testë
en prësence de billes d'alginate/pectine (Liu P. et a1.
(1999) Alginate/Pecti.n/Poly-L-lysine particulate as a potential controlled release formulation, J. Pharm.
Pharmacol., 51,141). Les billes rëticulées par la ~polylysine semblent libérer moins de principe actif en milieu acide (HCl 0,1N) que les billes non rëticulëes, sauf en prësence de principes actifs très hydrosolubles.
Le même type d'effet est retrouvé en milieu alcalïn (tampon phosphate pH 7,5) mais il est nettement moins marquë qu'en milieu acide.
La demande de brevet internationale WO 88/07865 suggère d'admïnistrer au niveau du colon des bactëries ~productri.aes de (3-lactamases afin d'-hydrolyser les antibiotiques rësiduels. Les micro-organismes utilisës sont des bactëries à mëtabolisme anaërobie strict, dont la production et la lyophilisation en quantitë suffisante pour ëlaborer un mëdicament sont difficiles. De plus, elles sont porteuses de gènes de rësistance aux antibiotiques encodant pour des (3-lactamases engendrant ainsi un risque de dissémination de ces gènes au sein de l'écosystème colique et dans l'environnement.
ha demande de brevet internationale WO 93/13795 propose une forme galénique orale contenant des ~-lactamases. Elle peut être composée de particules de saccharose de l à 2,5 mm de diamètre renfermant les (3-lactamases ou des amïdases et éventuellement un inhibiteur de la trypsine, lesdites particules étant recouvertes d'un polymère gastrorésistant. Ces particules auraient la possibilité de libérer l'enzyme au niveau des différents segments du tube digestif pour que son activité s'exerce selon les besoins au niveau désiré de l'intestin.
Aucun ales exemples ne comporte de données expérimentales montrant que la formulation galénique proposée est effectivement capable de délivrer l'enzyme sous forme active au niveau dësiré de l'intestin. De plus., aucune preuve de la capacité de la préparation galénique à hydrolyser effectivement l'antibiotique zn vivo, ni méme .in vitro dans un milieu reproduisant les caractéri tiques du milieu intestinal n'est apportée.
~0 Pour toutes ces raisons, il est hautement souhaitable de disposer d'un système destiné à réduire la quantité
des antibiotiques résiduels qui parviennent au colon après antibiothérapie orale ou parentérale, ou capable de délierer un principe actif directement au niveau du colon.
Ainsi, la présente invention a donc pour objet des formes galéniques multiparticulaires aptes à être utilisées par voie orale et destinées à la délivrance colique de principes actifs.
Au sens de la présente invention, on entend par principe actif une substance ou composition qui est apte à être utilisée en thérapeutique ou en diagnostic et peut être incorporée dans la forme galénique selon l'invention.
Ze principe actif peut être un anti-infectieux, par exemple les antibiotiques, des composés anti inflammatoires, anti-histaminiques, anti-cholinergiques, antiviraux, antimitotiques, des peptides, des protéines, des gènes, des olïgonucléotides antï-sens, des agents de diagnostic et/ou des agents ïmmunosuppressifs ou des bactéries.
Parmi les principes actifs particulièrement avantageux, on trouve les agents anti-inflammatoires, les agents antitumoraux, les oligonucléotides anti-sens et les enzymes capables d'inactiver les antibiotiques au niveau du colon, notamment les (3-lactamases ou les enzymes capables d'inactïVer les macrolides et apparentés comme l'érythromycine estérase décrite par Andremont A.
et al. ((1985) Plasmïd mediated susceptibility to intestinal microbial antagonisms in Escherichia soli Infect. Immun. 49(3), 751) ou capables d'inactiver les quinolones comme ceux décrits par Chen Y et al. ((1997) Mïcrobicïdal models of soïl metabolisms biotransformations of danofloxacin Journal of Industrial Microbiology and B.ioteehnology 19, 378) .
Les principes actifs peuvent être hydrosolubles ou liposolubles.
Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, les formes galéniques multiparticulaïres aptes à être utilisées par voie orale et destinées à 1a délivrance colique de principes actifs comprennent des billes de pectine présentes sous forme d'un sel cationique renfermant le principe actif, ladite pectine étant réticulée par un polymère cationique.
Dans un mode avantageux de réalisation selon l'ïnvention, le polymère cationique qui permet la réticulation de la pectine est choïsi dans le groupe composé de la polyéthylènimine, de la polylysine, du chitosan et de leurs dérivés.
Plus avantageusement, le poids moléculaire de ces polymères cationiques, est compris entre 10 000 et 100 000 Daltons, de préfërence entre ~0 000 et 50 000 Daltons.
Dans un autre mode avantageux de l'invention, le sel cationique de pectine utilisë est le pectinate de calcium.
Au sens de la présente invention, on entend par pectine aussi bien de la pectine méthylée ou non méthylée, amidée ou non amidée.
hes formes galéniques selon l''invention, peuvent être administrées sous toutes formes orales, notamment sous forme de gélules et de capsules.
Ces gélules et ces capsules peuvent être adminïstrées simultanément ou successivement avec d'autres principes actifs, notamment lorsque les gélules ou les capsules contiennent des enzymes capables d'inactiver les antibiotiques, elles peuvent être administrées simultanément ou successivement avec la préparation d'antibiotiques correspondants.
Les princïpés actifs administrés conjointement aux gélules et capsules contenant les formes galéniques selon l'invention sont administrés oralement ou par toute autre voie.
Tes formes galéniques_selon l'invention =peuvent être préparées par des méthodes connues de l'homme du métier ou par des procédés nouveaux qui font également partie de l'ïnvention.
Ainsi, la présente invention a ëgalement pour objet un procédé de préparation des formes galéniques multïparticulaires caractérisé en ce que l'on introduit goutte à goutte une solution aqueuse de pectine contenant le principe actif à une concentration de 0, 5 à 5 ~ (v/v) dans une solution de chlorure de calcïum pour former les billes de pectinate de calcium, puis on récupère les billes de pectinate de calcium ainsi obtenues et on les introduit dans une solution aqueuse du polymère cationique.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé, la solution de pectine est de 4 à 10 ~ (m/v) , de préférence de 4 à 7~, la solutïon de chlorure de calcium de 2 à 10%
(m/v) et la solution de po~.ymère catïonique de 0,5 à 2~
(m/v), ladite solution de polymère cationique étant de préfërence une solution de polyéthylènimine.
Dans un mode encore plus avantageux .de réalisation de ~0 l'invention, les formes galéniques sont préparées à
partir d'une solution de pectine à ~ô (m/v), d'une solution de chlorure de calcium à 6~ (m/v) et d'une solution de polyéthylènimine à 1~ ou à 0,6~.
Les billes sont maintenues dans le chlorure de calcium sous agitation lente pendant l0 min à 1 heure, de préférence pendant 20 min.
L'étape de réticulation par le polymère cationique est réalisée sous agitation lente pendant 15 à 40 min, de préférence pendant ~0 min,.
Après récupération des billes de pectinate, les billes sont séchées à une température comprise entre 20 et 40°C pendant 30 min à 10 heures, de préférence à 37°C
pendant 2 heures.
Le diamètre des particules selon l'invention est compris entre 800 et 1 500 gym, de préférence entre 1 000 5 et 1 200 gym.
hes rendements d'encapsulation sont compris entre 50 et 90% soit 3-6 UI/billes de (3-lactamases, activïté
exprimée en substrat benzylpénicilline, que la pectine soit amidée ou non.
10 La stabilité en milieu gastrique est supérieure à l0 heures et est également très bonne en milïeu intestinale USP XXIV, puisqu'elle est supérieure à 7 heures (la durée de stabilité des bïlles de pectine non réticulées n'excède pas 1 heure) et ce quelque soit le type de
L'obtention d'un profil de cinétique de libération adéquat dépend principalement du choix de la formulatïon et des conditïons opératoires pour la préparation des billes. Aucune corrélation in vitro/in vivo des profils de libération des principes actifs encapsulées n'a été
établie.
Afin d'augmenter la stabilité des particules le long du tractus digestif et d'éviter toute libération prématurée du principe actif encapsulé, il est possible de renforcer les billes de pectïne en les réticulant avec un polymère cationique.
Munjeri et al. ((1997) Hydrogel beads based on amidated pectins for colon-specific drag delïvery: the vole of chitosan in modifying drag release, Journal of Controlled Release, 46, 273) ont réticulé des billes de pectine amidée avec du chitosane. Ils ont alors montré, en comparant les cinétiques de dissolution de formes réticulées et de formes non réticulées, que le chitosane l5 permettait de minimiser la libération des principes actifs insolubles mais ne modifïait pas signïficativement la libération des principes actïfs hydrosolubles. La perte de principe actif dans des conditions mimant celles de l'estomac et de l'intestin grêle peut donc être limitée par la formation d'un complexe entre le chitosane et la pectine amidëe; les billes de pectine rëticulëes restant toujours sensibles à l'action des enzymes pectinolytiques coliques.
Un autre agent rëticulant, 1a polylysine, a étë testë
en prësence de billes d'alginate/pectine (Liu P. et a1.
(1999) Alginate/Pecti.n/Poly-L-lysine particulate as a potential controlled release formulation, J. Pharm.
Pharmacol., 51,141). Les billes rëticulées par la ~polylysine semblent libérer moins de principe actif en milieu acide (HCl 0,1N) que les billes non rëticulëes, sauf en prësence de principes actifs très hydrosolubles.
Le même type d'effet est retrouvé en milieu alcalïn (tampon phosphate pH 7,5) mais il est nettement moins marquë qu'en milieu acide.
La demande de brevet internationale WO 88/07865 suggère d'admïnistrer au niveau du colon des bactëries ~productri.aes de (3-lactamases afin d'-hydrolyser les antibiotiques rësiduels. Les micro-organismes utilisës sont des bactëries à mëtabolisme anaërobie strict, dont la production et la lyophilisation en quantitë suffisante pour ëlaborer un mëdicament sont difficiles. De plus, elles sont porteuses de gènes de rësistance aux antibiotiques encodant pour des (3-lactamases engendrant ainsi un risque de dissémination de ces gènes au sein de l'écosystème colique et dans l'environnement.
ha demande de brevet internationale WO 93/13795 propose une forme galénique orale contenant des ~-lactamases. Elle peut être composée de particules de saccharose de l à 2,5 mm de diamètre renfermant les (3-lactamases ou des amïdases et éventuellement un inhibiteur de la trypsine, lesdites particules étant recouvertes d'un polymère gastrorésistant. Ces particules auraient la possibilité de libérer l'enzyme au niveau des différents segments du tube digestif pour que son activité s'exerce selon les besoins au niveau désiré de l'intestin.
Aucun ales exemples ne comporte de données expérimentales montrant que la formulation galénique proposée est effectivement capable de délivrer l'enzyme sous forme active au niveau dësiré de l'intestin. De plus., aucune preuve de la capacité de la préparation galénique à hydrolyser effectivement l'antibiotique zn vivo, ni méme .in vitro dans un milieu reproduisant les caractéri tiques du milieu intestinal n'est apportée.
~0 Pour toutes ces raisons, il est hautement souhaitable de disposer d'un système destiné à réduire la quantité
des antibiotiques résiduels qui parviennent au colon après antibiothérapie orale ou parentérale, ou capable de délierer un principe actif directement au niveau du colon.
Ainsi, la présente invention a donc pour objet des formes galéniques multiparticulaires aptes à être utilisées par voie orale et destinées à la délivrance colique de principes actifs.
Au sens de la présente invention, on entend par principe actif une substance ou composition qui est apte à être utilisée en thérapeutique ou en diagnostic et peut être incorporée dans la forme galénique selon l'invention.
Ze principe actif peut être un anti-infectieux, par exemple les antibiotiques, des composés anti inflammatoires, anti-histaminiques, anti-cholinergiques, antiviraux, antimitotiques, des peptides, des protéines, des gènes, des olïgonucléotides antï-sens, des agents de diagnostic et/ou des agents ïmmunosuppressifs ou des bactéries.
Parmi les principes actifs particulièrement avantageux, on trouve les agents anti-inflammatoires, les agents antitumoraux, les oligonucléotides anti-sens et les enzymes capables d'inactiver les antibiotiques au niveau du colon, notamment les (3-lactamases ou les enzymes capables d'inactïVer les macrolides et apparentés comme l'érythromycine estérase décrite par Andremont A.
et al. ((1985) Plasmïd mediated susceptibility to intestinal microbial antagonisms in Escherichia soli Infect. Immun. 49(3), 751) ou capables d'inactiver les quinolones comme ceux décrits par Chen Y et al. ((1997) Mïcrobicïdal models of soïl metabolisms biotransformations of danofloxacin Journal of Industrial Microbiology and B.ioteehnology 19, 378) .
Les principes actifs peuvent être hydrosolubles ou liposolubles.
Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, les formes galéniques multiparticulaïres aptes à être utilisées par voie orale et destinées à 1a délivrance colique de principes actifs comprennent des billes de pectine présentes sous forme d'un sel cationique renfermant le principe actif, ladite pectine étant réticulée par un polymère cationique.
Dans un mode avantageux de réalisation selon l'ïnvention, le polymère cationique qui permet la réticulation de la pectine est choïsi dans le groupe composé de la polyéthylènimine, de la polylysine, du chitosan et de leurs dérivés.
Plus avantageusement, le poids moléculaire de ces polymères cationiques, est compris entre 10 000 et 100 000 Daltons, de préfërence entre ~0 000 et 50 000 Daltons.
Dans un autre mode avantageux de l'invention, le sel cationique de pectine utilisë est le pectinate de calcium.
Au sens de la présente invention, on entend par pectine aussi bien de la pectine méthylée ou non méthylée, amidée ou non amidée.
hes formes galéniques selon l''invention, peuvent être administrées sous toutes formes orales, notamment sous forme de gélules et de capsules.
Ces gélules et ces capsules peuvent être adminïstrées simultanément ou successivement avec d'autres principes actifs, notamment lorsque les gélules ou les capsules contiennent des enzymes capables d'inactiver les antibiotiques, elles peuvent être administrées simultanément ou successivement avec la préparation d'antibiotiques correspondants.
Les princïpés actifs administrés conjointement aux gélules et capsules contenant les formes galéniques selon l'invention sont administrés oralement ou par toute autre voie.
Tes formes galéniques_selon l'invention =peuvent être préparées par des méthodes connues de l'homme du métier ou par des procédés nouveaux qui font également partie de l'ïnvention.
Ainsi, la présente invention a ëgalement pour objet un procédé de préparation des formes galéniques multïparticulaires caractérisé en ce que l'on introduit goutte à goutte une solution aqueuse de pectine contenant le principe actif à une concentration de 0, 5 à 5 ~ (v/v) dans une solution de chlorure de calcïum pour former les billes de pectinate de calcium, puis on récupère les billes de pectinate de calcium ainsi obtenues et on les introduit dans une solution aqueuse du polymère cationique.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé, la solution de pectine est de 4 à 10 ~ (m/v) , de préférence de 4 à 7~, la solutïon de chlorure de calcium de 2 à 10%
(m/v) et la solution de po~.ymère catïonique de 0,5 à 2~
(m/v), ladite solution de polymère cationique étant de préfërence une solution de polyéthylènimine.
Dans un mode encore plus avantageux .de réalisation de ~0 l'invention, les formes galéniques sont préparées à
partir d'une solution de pectine à ~ô (m/v), d'une solution de chlorure de calcium à 6~ (m/v) et d'une solution de polyéthylènimine à 1~ ou à 0,6~.
Les billes sont maintenues dans le chlorure de calcium sous agitation lente pendant l0 min à 1 heure, de préférence pendant 20 min.
L'étape de réticulation par le polymère cationique est réalisée sous agitation lente pendant 15 à 40 min, de préférence pendant ~0 min,.
Après récupération des billes de pectinate, les billes sont séchées à une température comprise entre 20 et 40°C pendant 30 min à 10 heures, de préférence à 37°C
pendant 2 heures.
Le diamètre des particules selon l'invention est compris entre 800 et 1 500 gym, de préférence entre 1 000 5 et 1 200 gym.
hes rendements d'encapsulation sont compris entre 50 et 90% soit 3-6 UI/billes de (3-lactamases, activïté
exprimée en substrat benzylpénicilline, que la pectine soit amidée ou non.
10 La stabilité en milieu gastrique est supérieure à l0 heures et est également très bonne en milïeu intestinale USP XXIV, puisqu'elle est supérieure à 7 heures (la durée de stabilité des bïlles de pectine non réticulées n'excède pas 1 heure) et ce quelque soit le type de
15 pectine utilisé.
Zes exemples 1 à 7 et les figures 1 à 8 quï suivent illustrent l'invention.
La figure 1 représente l''effet de la réticulation avec différentes concentrations de PEI (0,6 ; 0,7 ; 0,8 ;
20 0,9 et lue) sur les temps de désagrégation de billes de pectine amidée, placées dans trois milieux différents:
PBS, 0, OZ M, pH à 7, 4; milieu intestinal au pH de 6, 8 +
0,1 UPS XXIV; milieu gastrique au pH de 1,1 USP XXIV.
La figure 2 illustre la structure des billes contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille et réticulées pendant 20 minutes à la PEI à 1~ et observées en microscopie électronique à balayage.
La figure 3 illustre 1a libération des (3-lactamases in vitro à partir de billes de pectine amidée réticulées préparées selon l'exemple 1 avec des concentrations en PEI de 0,6 et 0,7% et contenant environ 5 UI/bille,, placées en milieu intestinal USP XXIV puis en milieu colique (tampon HEPES pH 6 + enzymes pectinolytiques).
La figure 4 illustre l'évolution de l'activité
~i-lactamase dans les selles de souris en fonction du temps, après administration orale de billes de pectine réticulées à la PEI pre'parées selon l'exemple 1 et contenant 4,4 UI/bille.
La figure 5 illustre la structure des billes contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille 30 minutes après administration in vivo. Zes billes sont alors dans l'estomac. A et B reprësentant les billes entières et C et D les billes coupëes.
La figure 6 illustre la structure des bïlles contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille 2 heures après administration in vivo. Zes billes sont alors dans l'intestin grêle. A et B représentant les billes entières et C et 'D les bïlles coupées.
La figure 7 illustre la structure des billes contenant des '(3-lactamases à raison de 4,4 Ullbille 4 heures après administratïon in vivo. Les billes sont alors dans le colon. A et B représentant les billes entières et C et D les billes coupées.
La figure 8 ïllustre l'encapsulation, dans des .billes de pectine, d'ADN plasmidique libre ou complexé à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe).
Exemple 1: Préparation des formes galéniques On introduit goutte à goutte une solutièn aqueuse de pectine à 6~ (OF 4Q0 ou OG 275C Unipectine° de chez Degussa) dans une solution de chlorure de calcium à 6ô
(m/v). La solution de pectine est introduite dans la solution de chlorure de calcium grâce à une tubulure Tygon" raccordée à une pompe përistaltïque (Microperpex°
LKB Bromma). La solution passe au travers d'une aiguille de 0,8 mm de diamètre (21G, Nedus Terumo) pour former des gouttes de pectine qui au contact du chlorure de calcïum (40 ml) gélifient instantanément et donnent des billes de pectinate de calcïum. Les billes sont maintenues dans le chlorure de calcium, sous agïtation lente, pendant 20 minutes.
Les billes blanches ne contenant pas de principe actif (~-lactamases) sont obtenues en partant d'une solution de pectine amidée (OG 175C) ou non amidée (OF 400) à 6ô.
Pour la préparation des billes chargées, 1e prïncipe actif (~-lactamases,, pénïcillinases de type A extraite de Bacillus cereus de chez Sigma) est mélangé à la solution de pectine dans un rapport de 3 ~ (Vpa/Vpectine) .
Les billes de pectinate de calcium ainsi obtenues sont ensuite rëcupérëes par filtration, rincées à l'eau distïllée, placées sur une boîte de Pétri et séchées à
l'étuve à 37 °C pendant 2 heures.
Pour la réticulation à la polyéthylènimine les billes non séchées, récupérêes de la solution de CaCI~ par filtration, sont introduites dans une solution aqueuse de polyéthylènimine (PEI) à 1~ et y sont maintenues pendant 20 min sous légère agitation.
Les billes préparées à partir de la pectine non amidée OF
400 contiennent de 1 à 2, 5 UI/billes et les billes préparées à partir de pectine amidée OG 175C .contïennent de 1 à 5 UI/billes.
Exemple '2: Stabilité des billes 1. Mode opératoire.
Les billes sont préparées selon l'exemple 1 avec ou sans étape de rêticulation; la durée de réticulation dans la PEI est de 20 minutes dans des solutions de concentrations allant de 0,6 à 1ô.
Les billes sont placées soit dans du tampon phosphate (PBS O,OlM, pH 7,4), soit dans des milieux simulant les milieux digestifs (gastrique et intestinal USP XXIV) et le temps de désagrégation est observé.
2. Résultats.
Ils sont donnés dans la fïgure 1.
Les billes réticulées ou .non sont stables dans le PBS et dans le milieu gastrique. En revanche, les billes non réticulées sont instables dans 1e milieu intestinal, alors que les billes selon l'invention sont stables plus de 7 heures.
Exemp3e 3: Caractéristiques morphologiques des billes.
Elles sont illustrées dans les figures 2A à 2D.
On observe sur les coupes que le centre des billes est plein et dense. La coque en surface correspond à la PEI.
L'intérieur et l'extérieur ont des structures dïfférentes.
Exemple 4: Cinétique de libération in vitro 1. Mode opératoire.
Des billes réticulées avec deux concentrations dïffërentes en PEI (0,6 et 0,7ô) sont préparées selon, l'exemple 1 à partir de pectine amidée et contenant 5 UI/bille. Elles sont laissées pendant 5 heures dans un milieu intestinal USP XXIV à pH 6,8, puis introduites en milieu colique synthétique à pH 6 enfermant des enzymes pectinolytiques (Pectinex~ Ultra SPL).
On mesure l'activité [3-lactamase rësiduelle dans les billes au cours du temps par spectrophotométrie en présence de nïtrocéphine.
2. Résultats.
Ils sont illustrés dans la figure 3.
Après 5 heures d'incubation des billes en milieu intestinal (TSH) moins de 25ô de l'activité ~3-lactamases qu'elles contiennent sont libérés. La libération devient importante en milieu colique sous l'action des enzymes pectinolytiques (Tloa). pour les billes rëtieulées avec 0,6~ de PEI, alors que le témoin sans enzymes pectinolytiques (TzoH contrôle) ne présente pas de modifications significatives d'activité (3-lactamase. Par contre, les billes réticulées avec 0,7~ de PEI ne voit pas Leur activité diminuer aprës 5H en milieu colique.
Ainsi la concentration en PEI modifie la résistance des billes et joue sur les temps de libération des principes actifs en milieu colique.
Exemphe 5: Cinétique de libération in vivo.
1. Mode opératoire.
Cet essai a été réalisé sur des souris mâles CD1. Les billes contiennent 4 UI/bïlle.
On administre per os aux souris des gélules contenant 10 billes. On récupère les selles aux temps 0, 2H, 3H, 4H, 5H, 6H, 7H et 8H et on réalise le dosage des ~3-lactamases dans ces selles (essai conduit sur '5 .animaux pour chaque temps) . De ,plus, on sacrifie aux temps 30 min,, 2H et 4H
une souris afin de récupérer les billes dans son tube digestif et d'observer leurs modïfications morphologiques en microscopie électronique à balayage.
2. Résultats.
5 Tls sont illustrés dans les figures 4 à 7.
Zes billes arrivent intactes dans le colon après environ 3 heures de transit.
Ze taux de ~-lactamases lïbérées directement dans les selles de souris recueillies à différents temps après 10 l'absorption des billes par voie orale montre que l'activité j3-lactamases de base est faible au départ. 2 à
4 heures après l'administration, il y a une augmentation nette de cette activité, ce qui correspond bien au transit des billes (figure 4).
15 Zes photos prises en microscopie électronique à balayage montrent l'intêgrité de la bille dans les dïfférents endroits du tube digestif.
Za structure est légèrement fragilisée au niveau de l'intestin grêle et l'intérieur est complètement détruit 20 au niveau colique où les billes apparaissent porteuses d'une cavité.
Zes particules, illustrées dans la figure 5, ayant sëjour-né dans l'estomac ont un aspect très proche de celles n'ayant subi aucun traitement (fïgure 2). En effet 25 la surface a le même aspect rugueux et irrégulier (figures 5A et 5B), dû à la présence de polyéthylenimine, et la section des billes apparaît uniforme et dense (figures 5C et 5D) .
Au bout de 2 h, on voit ap-paraître une légère déformation des billes (figure 6A) mais les particules ont toujours le même aspect en surface (figure 6B) et une section dense (figure 6C) bien qu'un peu fragilisée par le séjour dans l'intestin grêle (figure 6D).
En fin de transit, c'est-à-dire 4 h après l'administration, les billes se retrouvent dans le colon;
l'aspect externe des particules est inchangé (figure 7A) avec les mêmes irrégularités de surface dues à la polyéthylenimine (figure 7B). En revanche, la section des billes est creuse (figure 7C et 7D), du fait de la dégradation du réseau central de pectinate de calcium par les enzymes pectinolytiques coliques. Au final, il ne reste que la « coque » externe formée par la polyëthylenimine.
Exemple 6: Encapsulation d'érythromycine estérase 6.1 Production d'une fraction soluble contenant l'érythromycine estérase 6.1.1. Mode opératoire Za culture est réalisée à partir de la souche d'E.coli C~00 pIP1100 de l'Institut Pasteur. Zes conditïons de culture sont les suivantes . ensemencement du milieu Mueller-Hinton à 0,5~ à partir d'une prëculture d'environ 20h, volumes de culture de 200 ou 400 mZ en erlenmeyer, agitation fixée à 150 rpm, température de 37°C.
Un test de LOTS a permis d'établir que la souche produisait bien de l'érythromycine estérase.
3,6L de culture d'E.coli 0600 pIP1100 ont ëtë concentrés selon le protocole suivant .
~ Centrïfugation pendant 15 min à 3 400 g ~ Reprise du culot dans du tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5, volume final 70 mL
~ 2ème centrifugation de surnageant l5 min à 3 400 g ~ Reprise du culot dans 20 mL de tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 ~ Rassemblement des culots des 2 centrifugations (environ 100 mL) ~ Lavage des culots et centrïfugation (10 min à 12 000 g) ~ 2ème centrifugation du surnageant (10 min 22 000 g) ~ Volume final des culots repris dans le tampon phosphate de potassium . 100 mL
L'érythromycine estérase est une enzyme intracellulaire.
C'est pourquoi sa solubïlisation nécessite le cassage des cellules. Cette opération a été effectuée par Bonification des culots de centrifugatïon repris dans le tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 selon le 1'5 protocole décrit ci-dessous.
~ Aj out de 1% Trïton X100 (v/v) ~ Refroidissement à 5°C
~ Phonolyse 7 cycles de 1 min, température initiale 5°C, température maximale 15°C, puissance . 100 (500W, 20kHz) ; température ramenée à 5°C après chaque cycle ~ Centrifugation 10 min â l2 000 g ~ Reprise du culot dans 10 mL de tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 ~ Récupération et congélation du surnageant (91 mL) -solution A
L'activité érythromycine estérase a été évaluée par le dosage microbiologique dans le urnageant et dans les insolubles (débris cellulaires) selon les techniques 50 connues de l'homme du métier.
6.1.2. Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau 2.
Tableau 2 Echantillon D iamtre d'inhibition (mm) Surnageant 31 25 18 -aprs 21 - 18 l4 Bonification Culot aprs 30 28 24 -sonification 22,5 - 19,5 l9 L''activité érythromycine estërase est évaluée à partir du diamètre d'inhibition.
Celle-ci est de 2 U/mL .pour le surnageant de phonolyse .et 1, 5 U/mL pour le culot de phonolyse (1 Unité (U) - 1 ~g d'ërythromycine dégradée par min).
Le bilan de xécupëration de l'activité érythromycïne estérase est présenté dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 chantillon Activit Volume (mL) Activit estime totale (U/mL) estime (U) Surnageant 2,0. 92 184 aprs Bonification Culot aprs 1,5 10 15 Bonification Les résultats montrent clairement que l'essentiel de l'activité érythromyc.ine estërase présente a bien été
solubilisée dans le milieu de phonolyse.
6.2 Encapsulation d'érythromycine estërase 6.2.1. Mode opératoire L'encapsulation est réalisée à partir de la fraction soluble non purifiée obtenue après cassage des cellules (solution A) selon le protocole suivant.
~ Solubilisation de 0,5 g de pectine dans les 10 mL de solution A afin d' obtenir une concentration finale de pectine de 5~ (solution B). La pectine est ajoutée très progressivement sous agitation magnétique afin de ne pas entxaîner de trop brusques variations de pH. Le pH est maintenu aux environs de 7 par addition de quelques gouttes de soude IM.
~ Dispersion de la solution de pectine (solutïon B) goutte à goutte à l'aide d'une pompe péristaltique dans 40 mL de CaCl~ â 6%. Les billes ainsi formées sont maintenues dans le CaCl~ pendant 2.0 mïn, récupérées par filtration sur Büchner puis rïncées à
l'eau déminéralisée.
~ Réticulation des billes par bain dans une solution de PEI à 0,6~ pendant 20 min sous agitation magnétique.
~ Récupératïon des billes réticulées par filtration.
~ Séchage des billes à température ambiante (20°C).
567 billes ont été préparées au total avec 6, 1 mL de mélange pectine/solution A, pour une activité de 12,2 U.
~ Désagrégation des billes séchées dans un tampon HEPES/NaCl/EDTA 1~.
6.2.2. Résultats L'activité érythromycine estërase présente dans la solution initiale de pectine et celle libérée dans le milieu de désagrégation sont dosées selon le même protocole que précédemment.
Les résultats du dosage microbiologique sont présentés dans les~Tableaux 4 et 5.
Tableau 4 chantillon Diamtre moyen d'inhibition Pectine / Solution A 23 (solution B)-TO
Pectine / Solution A -T3h 19 Billes dsagrges-TO 24 Billes dsagrges-T3h ~ 18 10 Tableau 5 chantillon Activit estime '(U) Pectine (Solution B) 2,4 Billes dsagrges 2,2 Les résultats montrent que l'activité mesurée en présence de pectine (solution B) est de 2,4 U, alors que 15 l'activité théorique présente devrait être d'environ 12 U
(6,1 mL à 2 U/mL, d'après le dosage d'ërythromycine estérase dans le surnageant de phonolyse (Tableau 3).
Le dosage de l'activité enzymatique de billes après désagrégation a été estimée à 2,2 U ; elle représente 90%
20 de l'activité initiale introduite dans les billes.
Ces résultats permettent d'établir sans ambiguïté la présence d'activité êrythromycïne estërase dans la fraction finale après encapsulation de l'enzyme et désagrégation des billes.
Ces résultats permettent d'établir sans ambiguïté la présence d'actïvité érythromycine estérase dans la fractïon finale après encapsulation de l'enzyme et désagrégation des billes.
Exemple 7: Encapsulation d'ADN dans les billes de pectinate de calcium 7.1 Préparation de l'ADN
Le princïpe actif encapsulé ici est un plasmide radiomarqué au Phosphore 33. Le radiomarquage se fait à
l'aide du « Nick Translation Kit » N5500 de chez Amersham Biosciences selon le protocole décrit par le fournisseur.
7.2 Encapsulation 7.2.1. Mode opératoïre L'ADN encapsulé est soit sous forme libre, soit complexé
,à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe) selon 1e mode opératoire décrit dans l'exemple 1.
Pour l'ADN libre, environ 5 ug d'ADN radiomarqué en solution dans 750 ~ZL d'eau MilliQ sont introduits dans 0,758 d'une solution de pectine, amidée ou non, à 10%
afïn d'obtenir une concentration finale en pectine cle 5~.
Dans le cas des lipoplexes, 375 ~L d'une solution aqueuse d'ADN radiomarqué sont mélangés à 375 p.L d'une suspension de liposomes cationiques (ratio N/P de 10). Les 750 ~L de lipoplexes ainsi obtenus sont ensuite mélangés à 0,75 g de solution de pectine à 10~ afin d'obtenir une concentration finale en pectine de 5~.
Dans le cas des polyplexes, 375 ~L d'une solution aqueuse d'ADN radiomarqué sont mélangés à 375 pL d'une solutïon aqueuse de PEI 4mM. 375 ,p.L de la suspension de polyplexes ainsi obtenus sont ensuite mélangés â 0,75 g de solution pectine à 10~ afin d'obtenïr une concentration finale en pectine de 5ô.
Zes billes de pectinate de calcïum encapsulant l'ADN
libre ou complexé sont ensuite préparées à partir des solutions obtenues ci-dessus selon la méthode décrite dans l'exemple 1. La concentration en chlorure de calcium utilisêe ici est de 5ô et celle de PEI pour la réticulation est de 0,6~.
7.2.2. Résultats Ils sont illustrés à la fïgure 8 qui montre les xendernents d'encapsulation d'un ADN plasmidique dans des billes de ..pectine amidée ou non amidée.
L'ADN encapsulé est soit sous forme libre, soït complexé
à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe).
Les rendements d'encapsulation en ADN varient entre 60 et 90~ selon le type de pectine utilisée. Ils sont généralement plus importants avec la pectine amidée. La complexation à des lipides ou à un polymère cationique n'entraîne pas de modifications significatives de ces rendements qui restent relativement élevés.
Zes exemples 1 à 7 et les figures 1 à 8 quï suivent illustrent l'invention.
La figure 1 représente l''effet de la réticulation avec différentes concentrations de PEI (0,6 ; 0,7 ; 0,8 ;
20 0,9 et lue) sur les temps de désagrégation de billes de pectine amidée, placées dans trois milieux différents:
PBS, 0, OZ M, pH à 7, 4; milieu intestinal au pH de 6, 8 +
0,1 UPS XXIV; milieu gastrique au pH de 1,1 USP XXIV.
La figure 2 illustre la structure des billes contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille et réticulées pendant 20 minutes à la PEI à 1~ et observées en microscopie électronique à balayage.
La figure 3 illustre 1a libération des (3-lactamases in vitro à partir de billes de pectine amidée réticulées préparées selon l'exemple 1 avec des concentrations en PEI de 0,6 et 0,7% et contenant environ 5 UI/bille,, placées en milieu intestinal USP XXIV puis en milieu colique (tampon HEPES pH 6 + enzymes pectinolytiques).
La figure 4 illustre l'évolution de l'activité
~i-lactamase dans les selles de souris en fonction du temps, après administration orale de billes de pectine réticulées à la PEI pre'parées selon l'exemple 1 et contenant 4,4 UI/bille.
La figure 5 illustre la structure des billes contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille 30 minutes après administration in vivo. Zes billes sont alors dans l'estomac. A et B reprësentant les billes entières et C et D les billes coupëes.
La figure 6 illustre la structure des bïlles contenant des (3-lactamases à raison de 4,4 UI/bille 2 heures après administration in vivo. Zes billes sont alors dans l'intestin grêle. A et B représentant les billes entières et C et 'D les bïlles coupées.
La figure 7 illustre la structure des billes contenant des '(3-lactamases à raison de 4,4 Ullbille 4 heures après administratïon in vivo. Les billes sont alors dans le colon. A et B représentant les billes entières et C et D les billes coupées.
La figure 8 ïllustre l'encapsulation, dans des .billes de pectine, d'ADN plasmidique libre ou complexé à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe).
Exemple 1: Préparation des formes galéniques On introduit goutte à goutte une solutièn aqueuse de pectine à 6~ (OF 4Q0 ou OG 275C Unipectine° de chez Degussa) dans une solution de chlorure de calcium à 6ô
(m/v). La solution de pectine est introduite dans la solution de chlorure de calcium grâce à une tubulure Tygon" raccordée à une pompe përistaltïque (Microperpex°
LKB Bromma). La solution passe au travers d'une aiguille de 0,8 mm de diamètre (21G, Nedus Terumo) pour former des gouttes de pectine qui au contact du chlorure de calcïum (40 ml) gélifient instantanément et donnent des billes de pectinate de calcïum. Les billes sont maintenues dans le chlorure de calcium, sous agïtation lente, pendant 20 minutes.
Les billes blanches ne contenant pas de principe actif (~-lactamases) sont obtenues en partant d'une solution de pectine amidée (OG 175C) ou non amidée (OF 400) à 6ô.
Pour la préparation des billes chargées, 1e prïncipe actif (~-lactamases,, pénïcillinases de type A extraite de Bacillus cereus de chez Sigma) est mélangé à la solution de pectine dans un rapport de 3 ~ (Vpa/Vpectine) .
Les billes de pectinate de calcium ainsi obtenues sont ensuite rëcupérëes par filtration, rincées à l'eau distïllée, placées sur une boîte de Pétri et séchées à
l'étuve à 37 °C pendant 2 heures.
Pour la réticulation à la polyéthylènimine les billes non séchées, récupérêes de la solution de CaCI~ par filtration, sont introduites dans une solution aqueuse de polyéthylènimine (PEI) à 1~ et y sont maintenues pendant 20 min sous légère agitation.
Les billes préparées à partir de la pectine non amidée OF
400 contiennent de 1 à 2, 5 UI/billes et les billes préparées à partir de pectine amidée OG 175C .contïennent de 1 à 5 UI/billes.
Exemple '2: Stabilité des billes 1. Mode opératoire.
Les billes sont préparées selon l'exemple 1 avec ou sans étape de rêticulation; la durée de réticulation dans la PEI est de 20 minutes dans des solutions de concentrations allant de 0,6 à 1ô.
Les billes sont placées soit dans du tampon phosphate (PBS O,OlM, pH 7,4), soit dans des milieux simulant les milieux digestifs (gastrique et intestinal USP XXIV) et le temps de désagrégation est observé.
2. Résultats.
Ils sont donnés dans la fïgure 1.
Les billes réticulées ou .non sont stables dans le PBS et dans le milieu gastrique. En revanche, les billes non réticulées sont instables dans 1e milieu intestinal, alors que les billes selon l'invention sont stables plus de 7 heures.
Exemp3e 3: Caractéristiques morphologiques des billes.
Elles sont illustrées dans les figures 2A à 2D.
On observe sur les coupes que le centre des billes est plein et dense. La coque en surface correspond à la PEI.
L'intérieur et l'extérieur ont des structures dïfférentes.
Exemple 4: Cinétique de libération in vitro 1. Mode opératoire.
Des billes réticulées avec deux concentrations dïffërentes en PEI (0,6 et 0,7ô) sont préparées selon, l'exemple 1 à partir de pectine amidée et contenant 5 UI/bille. Elles sont laissées pendant 5 heures dans un milieu intestinal USP XXIV à pH 6,8, puis introduites en milieu colique synthétique à pH 6 enfermant des enzymes pectinolytiques (Pectinex~ Ultra SPL).
On mesure l'activité [3-lactamase rësiduelle dans les billes au cours du temps par spectrophotométrie en présence de nïtrocéphine.
2. Résultats.
Ils sont illustrés dans la figure 3.
Après 5 heures d'incubation des billes en milieu intestinal (TSH) moins de 25ô de l'activité ~3-lactamases qu'elles contiennent sont libérés. La libération devient importante en milieu colique sous l'action des enzymes pectinolytiques (Tloa). pour les billes rëtieulées avec 0,6~ de PEI, alors que le témoin sans enzymes pectinolytiques (TzoH contrôle) ne présente pas de modifications significatives d'activité (3-lactamase. Par contre, les billes réticulées avec 0,7~ de PEI ne voit pas Leur activité diminuer aprës 5H en milieu colique.
Ainsi la concentration en PEI modifie la résistance des billes et joue sur les temps de libération des principes actifs en milieu colique.
Exemphe 5: Cinétique de libération in vivo.
1. Mode opératoire.
Cet essai a été réalisé sur des souris mâles CD1. Les billes contiennent 4 UI/bïlle.
On administre per os aux souris des gélules contenant 10 billes. On récupère les selles aux temps 0, 2H, 3H, 4H, 5H, 6H, 7H et 8H et on réalise le dosage des ~3-lactamases dans ces selles (essai conduit sur '5 .animaux pour chaque temps) . De ,plus, on sacrifie aux temps 30 min,, 2H et 4H
une souris afin de récupérer les billes dans son tube digestif et d'observer leurs modïfications morphologiques en microscopie électronique à balayage.
2. Résultats.
5 Tls sont illustrés dans les figures 4 à 7.
Zes billes arrivent intactes dans le colon après environ 3 heures de transit.
Ze taux de ~-lactamases lïbérées directement dans les selles de souris recueillies à différents temps après 10 l'absorption des billes par voie orale montre que l'activité j3-lactamases de base est faible au départ. 2 à
4 heures après l'administration, il y a une augmentation nette de cette activité, ce qui correspond bien au transit des billes (figure 4).
15 Zes photos prises en microscopie électronique à balayage montrent l'intêgrité de la bille dans les dïfférents endroits du tube digestif.
Za structure est légèrement fragilisée au niveau de l'intestin grêle et l'intérieur est complètement détruit 20 au niveau colique où les billes apparaissent porteuses d'une cavité.
Zes particules, illustrées dans la figure 5, ayant sëjour-né dans l'estomac ont un aspect très proche de celles n'ayant subi aucun traitement (fïgure 2). En effet 25 la surface a le même aspect rugueux et irrégulier (figures 5A et 5B), dû à la présence de polyéthylenimine, et la section des billes apparaît uniforme et dense (figures 5C et 5D) .
Au bout de 2 h, on voit ap-paraître une légère déformation des billes (figure 6A) mais les particules ont toujours le même aspect en surface (figure 6B) et une section dense (figure 6C) bien qu'un peu fragilisée par le séjour dans l'intestin grêle (figure 6D).
En fin de transit, c'est-à-dire 4 h après l'administration, les billes se retrouvent dans le colon;
l'aspect externe des particules est inchangé (figure 7A) avec les mêmes irrégularités de surface dues à la polyéthylenimine (figure 7B). En revanche, la section des billes est creuse (figure 7C et 7D), du fait de la dégradation du réseau central de pectinate de calcium par les enzymes pectinolytiques coliques. Au final, il ne reste que la « coque » externe formée par la polyëthylenimine.
Exemple 6: Encapsulation d'érythromycine estérase 6.1 Production d'une fraction soluble contenant l'érythromycine estérase 6.1.1. Mode opératoire Za culture est réalisée à partir de la souche d'E.coli C~00 pIP1100 de l'Institut Pasteur. Zes conditïons de culture sont les suivantes . ensemencement du milieu Mueller-Hinton à 0,5~ à partir d'une prëculture d'environ 20h, volumes de culture de 200 ou 400 mZ en erlenmeyer, agitation fixée à 150 rpm, température de 37°C.
Un test de LOTS a permis d'établir que la souche produisait bien de l'érythromycine estérase.
3,6L de culture d'E.coli 0600 pIP1100 ont ëtë concentrés selon le protocole suivant .
~ Centrïfugation pendant 15 min à 3 400 g ~ Reprise du culot dans du tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5, volume final 70 mL
~ 2ème centrifugation de surnageant l5 min à 3 400 g ~ Reprise du culot dans 20 mL de tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 ~ Rassemblement des culots des 2 centrifugations (environ 100 mL) ~ Lavage des culots et centrïfugation (10 min à 12 000 g) ~ 2ème centrifugation du surnageant (10 min 22 000 g) ~ Volume final des culots repris dans le tampon phosphate de potassium . 100 mL
L'érythromycine estérase est une enzyme intracellulaire.
C'est pourquoi sa solubïlisation nécessite le cassage des cellules. Cette opération a été effectuée par Bonification des culots de centrifugatïon repris dans le tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 selon le 1'5 protocole décrit ci-dessous.
~ Aj out de 1% Trïton X100 (v/v) ~ Refroidissement à 5°C
~ Phonolyse 7 cycles de 1 min, température initiale 5°C, température maximale 15°C, puissance . 100 (500W, 20kHz) ; température ramenée à 5°C après chaque cycle ~ Centrifugation 10 min â l2 000 g ~ Reprise du culot dans 10 mL de tampon phosphate de potassium 5mM, pH 7,5 ~ Récupération et congélation du surnageant (91 mL) -solution A
L'activité érythromycine estérase a été évaluée par le dosage microbiologique dans le urnageant et dans les insolubles (débris cellulaires) selon les techniques 50 connues de l'homme du métier.
6.1.2. Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau 2.
Tableau 2 Echantillon D iamtre d'inhibition (mm) Surnageant 31 25 18 -aprs 21 - 18 l4 Bonification Culot aprs 30 28 24 -sonification 22,5 - 19,5 l9 L''activité érythromycine estërase est évaluée à partir du diamètre d'inhibition.
Celle-ci est de 2 U/mL .pour le surnageant de phonolyse .et 1, 5 U/mL pour le culot de phonolyse (1 Unité (U) - 1 ~g d'ërythromycine dégradée par min).
Le bilan de xécupëration de l'activité érythromycïne estérase est présenté dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 chantillon Activit Volume (mL) Activit estime totale (U/mL) estime (U) Surnageant 2,0. 92 184 aprs Bonification Culot aprs 1,5 10 15 Bonification Les résultats montrent clairement que l'essentiel de l'activité érythromyc.ine estërase présente a bien été
solubilisée dans le milieu de phonolyse.
6.2 Encapsulation d'érythromycine estërase 6.2.1. Mode opératoire L'encapsulation est réalisée à partir de la fraction soluble non purifiée obtenue après cassage des cellules (solution A) selon le protocole suivant.
~ Solubilisation de 0,5 g de pectine dans les 10 mL de solution A afin d' obtenir une concentration finale de pectine de 5~ (solution B). La pectine est ajoutée très progressivement sous agitation magnétique afin de ne pas entxaîner de trop brusques variations de pH. Le pH est maintenu aux environs de 7 par addition de quelques gouttes de soude IM.
~ Dispersion de la solution de pectine (solutïon B) goutte à goutte à l'aide d'une pompe péristaltique dans 40 mL de CaCl~ â 6%. Les billes ainsi formées sont maintenues dans le CaCl~ pendant 2.0 mïn, récupérées par filtration sur Büchner puis rïncées à
l'eau déminéralisée.
~ Réticulation des billes par bain dans une solution de PEI à 0,6~ pendant 20 min sous agitation magnétique.
~ Récupératïon des billes réticulées par filtration.
~ Séchage des billes à température ambiante (20°C).
567 billes ont été préparées au total avec 6, 1 mL de mélange pectine/solution A, pour une activité de 12,2 U.
~ Désagrégation des billes séchées dans un tampon HEPES/NaCl/EDTA 1~.
6.2.2. Résultats L'activité érythromycine estërase présente dans la solution initiale de pectine et celle libérée dans le milieu de désagrégation sont dosées selon le même protocole que précédemment.
Les résultats du dosage microbiologique sont présentés dans les~Tableaux 4 et 5.
Tableau 4 chantillon Diamtre moyen d'inhibition Pectine / Solution A 23 (solution B)-TO
Pectine / Solution A -T3h 19 Billes dsagrges-TO 24 Billes dsagrges-T3h ~ 18 10 Tableau 5 chantillon Activit estime '(U) Pectine (Solution B) 2,4 Billes dsagrges 2,2 Les résultats montrent que l'activité mesurée en présence de pectine (solution B) est de 2,4 U, alors que 15 l'activité théorique présente devrait être d'environ 12 U
(6,1 mL à 2 U/mL, d'après le dosage d'ërythromycine estérase dans le surnageant de phonolyse (Tableau 3).
Le dosage de l'activité enzymatique de billes après désagrégation a été estimée à 2,2 U ; elle représente 90%
20 de l'activité initiale introduite dans les billes.
Ces résultats permettent d'établir sans ambiguïté la présence d'activité êrythromycïne estërase dans la fraction finale après encapsulation de l'enzyme et désagrégation des billes.
Ces résultats permettent d'établir sans ambiguïté la présence d'actïvité érythromycine estérase dans la fractïon finale après encapsulation de l'enzyme et désagrégation des billes.
Exemple 7: Encapsulation d'ADN dans les billes de pectinate de calcium 7.1 Préparation de l'ADN
Le princïpe actif encapsulé ici est un plasmide radiomarqué au Phosphore 33. Le radiomarquage se fait à
l'aide du « Nick Translation Kit » N5500 de chez Amersham Biosciences selon le protocole décrit par le fournisseur.
7.2 Encapsulation 7.2.1. Mode opératoïre L'ADN encapsulé est soit sous forme libre, soit complexé
,à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe) selon 1e mode opératoire décrit dans l'exemple 1.
Pour l'ADN libre, environ 5 ug d'ADN radiomarqué en solution dans 750 ~ZL d'eau MilliQ sont introduits dans 0,758 d'une solution de pectine, amidée ou non, à 10%
afïn d'obtenir une concentration finale en pectine cle 5~.
Dans le cas des lipoplexes, 375 ~L d'une solution aqueuse d'ADN radiomarqué sont mélangés à 375 p.L d'une suspension de liposomes cationiques (ratio N/P de 10). Les 750 ~L de lipoplexes ainsi obtenus sont ensuite mélangés à 0,75 g de solution de pectine à 10~ afin d'obtenir une concentration finale en pectine de 5~.
Dans le cas des polyplexes, 375 ~L d'une solution aqueuse d'ADN radiomarqué sont mélangés à 375 pL d'une solutïon aqueuse de PEI 4mM. 375 ,p.L de la suspension de polyplexes ainsi obtenus sont ensuite mélangés â 0,75 g de solution pectine à 10~ afin d'obtenïr une concentration finale en pectine de 5ô.
Zes billes de pectinate de calcïum encapsulant l'ADN
libre ou complexé sont ensuite préparées à partir des solutions obtenues ci-dessus selon la méthode décrite dans l'exemple 1. La concentration en chlorure de calcium utilisêe ici est de 5ô et celle de PEI pour la réticulation est de 0,6~.
7.2.2. Résultats Ils sont illustrés à la fïgure 8 qui montre les xendernents d'encapsulation d'un ADN plasmidique dans des billes de ..pectine amidée ou non amidée.
L'ADN encapsulé est soit sous forme libre, soït complexé
à des lipides cationiques (Lipoplexe) ou à un polymère cationique (Polyplexe).
Les rendements d'encapsulation en ADN varient entre 60 et 90~ selon le type de pectine utilisée. Ils sont généralement plus importants avec la pectine amidée. La complexation à des lipides ou à un polymère cationique n'entraîne pas de modifications significatives de ces rendements qui restent relativement élevés.
Claims (11)
1. Formes galéniques multiparticulaires aptes à être utilisées par voie orale et destinées à la délivrance colique de principes actifs choisis dans le groupe comprenant les enzymes capables d'inactiver les macrolides et apparentés et les enzymes capables d'inactiver les quinolones.
2. Formes galéniques multiparticulaires selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'enzyme capable d'inactiver les macrolides est l'érythromycine estérase.
3. Formes galéniques multiparticulaires caractérisées en ce qu'elles sont aptes à être utilisées par voie orale et destinées à la délivrance colique de principes actifs comprenant des billes de pectine présente sous forme d'un sel cationique renfermant le principe actif, ladite pectine étant réticulée par un polymère cationique.
4. Forme galénique selon la revendication 3, caractérisée en ce que le polymère cationique est choisi dans le groupe constitué par la polyéthylènimine, la polylysine, le chitosan et leurs dérivés.
5. Formes galéniques selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisées en ce que le polymère cationique a un poids moléculaire compris entre 10 000 et 100 000 Daltons, de préférence entre 20 000 et 50 000 Daltons.
6. Formes galéniques selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisées en ce que le sel de pectine est un pectinate de calcium préparé à partir de pectine amidée ou non amidée.
7. Formes galéniques selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont préparées à partir d'une solution de pectine à 4-10%
(m/v), avantageusement de 4 à 7% (m/v), d'une solution de chlorure de calcium é 2-10% (m/v) et d'une solution de polyéthylènimine à 0,5-2% (m/v).
(m/v), avantageusement de 4 à 7% (m/v), d'une solution de chlorure de calcium é 2-10% (m/v) et d'une solution de polyéthylènimine à 0,5-2% (m/v).
8. Formes galéniques selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisées en ce que la solution de pectine est à 6%, la solution de chlorure de calcium à
et la solution de polyéthylènimine à 1% ou 0,6%.
et la solution de polyéthylènimine à 1% ou 0,6%.
9. Formes galéniques selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisées en ce que le principe actif est choisi parmi les antibiotiques, les composés anti-inflammatoires, anti-histaminiques, anti-cholinergiques, antiviraux, antimitotiques, les peptides, les protéines, les gènes, les oligonucléotides anti-sens, les agents de diagnostic, les agents immunosuppressifs et/ou les bactéries, de préférence parmi les agents antitumoraux et les enzymes capables d'inactiver les antibiotiques au niveau du colon.
10. Formes galéniques selon la revendication 9, caractérisées en ce que les enzymes sont choisis dans le groupe constitué par les .beta.-lactamases, les enzymes capables d'inactiver les macrolides et apparentés, de préférence l'érytrhomycine estérase et les enzymes capables d'inactiver les quinolones.
11. Procédé de préparation d'une forme galénique selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'on ajoute une solution aqueuse de pectine contenant le principe actif à une solution aqueuse d'un sel cationique divalent, de manière à obtenir des billes de pectine sous forme d'un sel cationique renfermant le principe actif, et que l'on réticule lesdites billes par introduction dans une solution aqueuse du polymère cationique.
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