CN1874679A

CN1874679A - 采用包含阴离子多糖的原位凝胶对生理活性剂所进行的输送

Info

Publication number: CN1874679A
Application number: CNA2004800248478A
Authority: CN
Inventors: 倪亚炜; 肯尼斯·M·亚茨
Original assignee: Carrington Laboratories Inc
Current assignee: Carrington Laboratories Inc
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-05-24
Publication date: 2006-12-06
Also published as: EP1663111A4; EA010351B1; WO2005023176A2; US20050084534A1; JP2007504129A; EA200600484A1; CA2537290C; AU2004270101A1; CA2537290A1; US7494669B2; EP1663111A2; WO2005023176A3; JP4765020B2; KR20060127841A

Abstract

本发明涉及用于以液体、固体和粉末的形式将药学活性剂输送到动物患者的组织、体液和粘膜表面的原位凝胶组合物，所述组合物含有阴离子多糖和甲基特别少的果胶作为胶凝剂，本发明还涉及所述原位凝胶组合物的制备方法，以及使用所述原位凝胶组合物将生理活性剂尤其是疫苗抗原输送和持续释放到动物的组织中和粘膜表面上。

Description

采用包含阴离子多糖的原位凝胶对生理活性剂所进行的输送

相关申请的信息

本申请是2003年8月29日提交的系列号为10/652622的美国实用专利申请的部分继续申请，并要求该专利申请的优先权，在此通过参考引入该专利申请所公开的全部内容。

背景技术

已有多种用以实现药物的持续或可控释放的基于聚合物的药物输送系统(参见Langer，Nature，392(增刊)，5～10，1998及其中的参考文献)。许多所述系统的目的通常是以下一个或多个：延长药物的释放、改善药物的生物利用度、和/或提供非注射给药系统以增加患者的顺应性及舒适性。根据这种合成或天然的聚合物的特性，采用各种机制对各种试剂进行输送。

基于聚合物的系统已被制成各种剂型，例如液体制剂、悬浮剂、乳剂、含有微粒和/或微球体的粉末、膜剂或片剂。这些组合物已通过各种途径或方法进行输送，所述途径或方法包括注射、局部施用，或施用于眼、阴道、肛门、胃或肠、口鼻腔或肺的粘膜表面。基于聚合物的系统已用于输送包括治疗和预防试剂在内的许多生理活性剂，所述治疗和预防试剂包括基于小分子或蛋白的药物、核酸、多糖、脂肪酸和酯、细胞及其部分、病毒和用于预防传染性疾病的疫苗。

在现有技术中，许多用于药物输送的基于聚合物的系统，在输送至患者之前，药物和/或其它药物活性物质被包覆在可吸水但基本不溶于水的聚合物或凝胶中。凝胶是固体或可变形的果冻样的半固体，包含多孔性三维网络的聚合物分子，包含在该聚合物网络的孔隙中的是可逆吸收的液体(即非连续的液相)。凝胶经常可以包含和/或吸收大量和/或优势量的液体，该液体通常是水或其它包括生物流体在内的水性流体，但凝胶化的聚合物分子的网络基本上不溶于本体液体(bulk liquid)或生物流体中。单个的聚合物分子通过各种方式交联形成不溶性网络，这取决于该聚合物的性质。聚合物分子之间的交联可以通过共价健、配位健或离子相互作用或甚至较弱的分子间力如氢健进行。

各种合成和天然的聚合物也已用于药物输送剂型，所述剂型采用诸如淀粉和改性的纤维素、结冷胶(gellan)、壳聚糖、透明质酸、果胶等聚合物。例如，美国专利4,613,500公开了用于经鼻施用的多种粉末药物组合物，该粉末药物组合物包含包括果胶在内的多种水溶性和非水溶性聚合物，但该专利没有描述或建议利用可形成钙交联凝胶的低甲氧基果胶。最近，美国专利5,707,644和5,804,212披露了采用包括果胶在内的一长串的聚合物的下述用途：它们用于制备直径低于10微米的生物粘附性微球体，利用所述微球体可将药物、肽和抗原性疫苗输送到鼻腔表面；所述专利还建议将组合物与能够原位成胶的聚合物材料一起制成剂型，但没有教导或暗示将低甲氧基果胶用于原位凝胶化。

“原位”凝胶化在一些现有技术的药物输送系统和组合物中已有描述，其涉及：当将组合物或剂型施用到患者的粘膜表面、组织、伤口、非肠胃腔等之后，在施用位点形成凝胶。“原位”凝胶组合物只有在与组织或体液接触之后才形成生物粘附性凝胶。原位凝胶组合物本身的聚合物分子在施用到生物位点之前通常没有交联，或交联不充分，以便在施用到生物位点之前处于不溶于水的凝胶形式，但在施用到生物位点时或施用到生物位点后短时间内，通常发生聚合物交联以形成交联的聚合物凝胶网络，在该聚合物凝胶网络的多孔性网络结构中，包含有水和/或生物流体。原位凝胶一旦形成，至少在正常生理条件下，基本上和/或有效地不溶于水或生物流体。水和/或体内流体的吸收通常与原位成胶过程同时发生，但不溶性聚合物网络在施用到施用位点时形成，而不是仅仅吸收水或流体，这是确定原位凝胶的主要现象。

可以原位凝胶化的聚合物先前已有描述，包括泊洛沙姆、普鲁尼克(Vadnere等，Int.J.Pharm.，22，207～218，1984)、各种共聚物例如PEO-PLLA和PEG-PLGA-PEG(Jeong等，Nature 388，860～862，1997；Jeong等，J.Controlled Release 63，155～163，2000)、纤维素乙酰邻苯二甲酸乳胶(Gurny等，J.Controlled Release 353～361，1985)、Gelrite(Rozier等，Int.J Pham.57，163～168，1989)、卡波普和基质胶。凝胶的形成可由温度变化诱导(泊洛沙姆、普鲁尼克、PEO-PLLA二嵌段共聚物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物和基质胶)、或由pH变化诱导(纤维素乙酰邻苯二甲酸乳胶和卡波普)或与单价或双价阳离子发生反应而诱导(Gelrite和/或藻酸盐)。然而，大多数原位凝胶的形成都要求高聚合物浓度(大于20％)(泊洛沙姆、PEO-PLLA二嵌段共聚物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物、纤维素和乙酰邻苯二甲酸乳胶)。由于在包装或贮藏过程中存在温度变化，因而热敏性凝胶聚合物(泊洛沙姆、普鲁尼克、PEO-PLLA二嵌段共聚物、PEG-PLGA-PE三嵌段共聚物和基质胶)具有在施用之前成胶的缺点。遗憾的是，这些聚合物中有的(例如泊洛沙姆)不具有生物降解性或在给药前(PEO-PLLA二嵌段共聚物)或配制过程中(普鲁尼克和Gelrite)需要控制温度。已发现，由卡波普和普鲁尼克的混合物组成的眼科原位凝胶药物输送剂型比单独由其中之一组成的药物输送剂型更有效。然而，普鲁尼克以14％使用(Lin和Sung，Journal ofControlled Release 69，379～388，2000)。因此这种聚合物不太适合于人和动物的医药应用。而且，这些聚合物中的许多聚合物只形成有粘性但仍然是流动溶液的水凝胶(如泊洛沙姆和普鲁尼克)。

美国专利5,958,443公开了原位凝胶组合物，其披露了包含药物、成膜聚合物和成胶离子型多糖的液体组合物。这些组合物采用了两种分开施用的组分，第一组分是与二价或多价阳离子″外部″交联的液体，施用到欲进行生物施用的预定位点。在一个分开步骤中(可在施用第一组分溶液之前、之后或同时进行)，将含有药物、成膜聚合物和离子型多糖(例如藻酸盐)的第二液体组分溶液单独施用到预定位点，结果是离子型多糖和二价或多价阳离子在生物施用位点发生化学交联反应而形成交联的、不溶性和生物粘附性的原位凝胶。专利5,958,443描述了果胶作为许多成膜聚合物中的一种，而不是作为成胶离子型多糖。

果胶是分离自植物细胞壁的生物可降解的杂多糖，在该聚合物的半乳糖醛酸残基上具有羧酸侧链基团。经检测表明，所有蔬菜和果实均含有果胶。来自制糖甜菜、向日葵、马铃薯和葡萄的果胶仅仅是熟知的一些例子。实际上，几乎所有天然果胶的羧酸酯基团的50％以上是以甲酯形式存在，这类果胶被称为“高甲氧基”(HM)果胶。甲酯化的羧酸酯基团低于50％的果胶(即，低甲氧基(LM)果胶)在自然中是不常见的，并且其通常是由天然的HM果胶经合成加工而制备的。在本领域中已知的是，LM果胶能够与二价或多价金属离子如钙离子通过配位/交联而形成凝胶。果胶的化学和生物特性已有详细的综述(Pilnik和Voragen，Advances in plant biochemistry and biotechnology 1，219～270，1992；Voragen等，In Food polysaccharides and their applications。第287～339页。Marcel Dekker，Inc.New York，1995；Schols和Voragen，In Progress inBiotechnology 14.Pectins and pectinases，J.Visser和A.G.J.Voragen(编).第3～20页，Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam，1996)。

最近，美国专利6,432,440披露了LM果胶在下述液体药物剂型中的用途，该液体药物剂型通过与粘膜表面接触而适于成胶。美国专利6,342,251公开了包括果胶在内的多种聚合物在适于治疗勃起障碍的经鼻施用的液体或固体剂型中的用途。在此通过参考方式引入美国专利6,432,440、6,342,251、5,707,644和5,804,212所描述的全部内容，上述专利作为整体教导了有关原位成胶药物组合物的配制、用于制备所述组合物的果胶以及采用该组合物对动物和人所进行的施用。

Anderson等(Vaccine，19，840～843，2001)描述了用于动物抗牛疫的经鼻给药的粉末疫苗，该疫苗是通过将冻干抗原与4mm尼龙球掺和，并与滑石粉(碳酸钙)混和而制成。Maa等(美国专利出版物2002/0120228)描述了成胶型粉末疫苗组合物，该组合物包含吸附有抗原的铝盐、糖类、氨基酸、以及其中可含有多糖的胶体物质，该组合物可以通过透皮输送而施用于患者。

含有低于5微米的小颗粒的粉末也已用来对肺部药物进行深肺输送。乳糖颗粒也已被当作粗颗粒本体载体而与用于所述肺部药物输送的药物的微粉化颗粒相混合(Malcomson和Embleton，Pharmacuetical Scienceand Technology Today，第1(9)卷，394～398，1998)。LiCalsi等(Vaccine，第19卷，2629～2636，2001)制备了一种冻干的活麻疹肺用粉末疫苗。在上述引用的现有技术中，药物或抗原与载体颗粒物理性混合或分散于载体颗粒的表面，但不分散于整个乳糖基质中。

最近，Illum等在以下两篇刊物中综述了药物和疫苗的经鼻输送的现有技术状况，即，Advanced Drug Delivery Reviews中的″Nasal Vaccines″，第51卷，第21～42页，2001和发表于 www.drugdiscoverytoday.com，在第7卷，第23期，2002年12月的″Nasal Drug Delivery：New Developments andStrategies″。这两篇文章讨论了聚合的和/或高粘度的生物粘附性材料在配制用于经鼻疫苗和/或药物的输送的粉末中的用途，但均没有公开或建议经鼻给药的粉末疫苗组合物应包含中量至大量的高度水溶性赋形剂和/或稀释剂。在此通过参考引入上述引用的专利和期刊的所有内容，上述专利作为整体教导了经鼻给药的粉末组合物的配制，以及将所述组合物施用于动物和人的方法。

近年来，用于药物输送的生物技术和相关方法以及有关的生物药物试剂已经有了深入的研究，但这些试剂尤其是生物药物试剂的输送方面进展有限。生物药物试剂，例如肽、蛋白、核酸、疫苗、抗原和生物工程细胞、微生物和病毒在贮藏中和施用后都趋于不稳定。将这些试剂注射到动物或人的组织中有时是成功的，但在经济和审美学上是不受欢迎的，尤其是在需要频繁施用的情况下。许多生物药物试剂尤其是高分子量和极性较大的试剂，例如蛋白、核酸、抗原等，在过去经口服或施用于粘膜上是很难被吸收的。由于快速的转化以及鼻粘膜流体的清除作用，对鼻粘膜表面进行施用特别的困难，据认为从鼻腔中清除的半衰期处于15分钟级别。一旦成功输送于动物，许多生物药物试剂在有效地发挥所需作用之前就很快被降解，因此需要进行保护以免降解和/或利用时控释放剂型的优点。因此，在生物药物试剂的输送领域中，仍然存在早已意识但仍未满足的需求。

因而，用于生物药物试剂输送的简单、改善的和/或有效的原位成胶组合物具有很大的需求。

发明内容

本文公开的发明涉及生理活性剂对包括人在内的动物的组织或体液所进行的输送。本发明涉及制备和施用含有包括果胶在内的多糖的药物组合物的方法，所述多糖在与组织或体液接触时形成含有生理活性剂的“原位”凝胶。本发明的组合物可以以液体或固体或含有大小范围经过选择的微球体或微粒的粉末的形式施用于动物及其组织和体液。

可以将本发明的组合物制备成用以改善敏感的生物药物(其包括肽、蛋白、抗原、疫苗、核酸、病毒、全细胞或其部分)的稳定性和/或贮藏期限的剂型。所述组合物可通过注射施用至身体组织、器官或腔室内，以便使体液例如血液或血清与其中的凝胶相接触而进行施用；或者可将所述组合物施用至身体的各种粘膜表面，包括口腔/消化道或鼻和肺腔的粘膜表面。原位凝胶一旦形成，可以减缓和/或调整生理活性剂的释放，或者改善生理活性剂的生物利用度。在一些实施方式中，采用所述施用技术，可以意外地改进生物分子例如疫苗、抗原、肽和/或蛋白通过鼻腔内形成原位凝胶所进行的施用。

在本发明一些方面，在组合物中包埋或共施用固体或凝胶诱导剂和/或其中含有二价或多价阳离子的组合物，可以改善凝胶的形成和控制药物的释放。

通过下面的实施方式可以阐明本发明的特点和优点。

一方面，本发明涉及用以将生理活性剂施用于动物的固药物组合物，该组合物包含：

a)有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；和

b)包含具有阴离子羧酸酯或硫酸酯基团的亚单元的一种或多种多糖，以及

c)一种或多种固体多糖凝胶化组合物，该组合物包含一种或多种药学可接受的二价或多价金属阳离子的盐；

其中药物组合物为固体形式，当与动物的组织或体液接触时形成凝胶。

另一方面，本发明涉及用以将生理活性剂施用于动物的固药物组合物，该组合物包含：

a)一种或多种生理活性剂；和

b)一种或多种果胶质(pectic substance)，

其中药物组合物为固体，当与动物的组织或体液接触时形成凝胶。

在一个相关的方面，本发明提供用于在动物中持续释放生理活性剂的组合物，其中所述组合物为干燥形式，其包含：

在动物体内产生生理反应的量的一种或多种生理活性剂；和

甲基化程度低于30％且平均分子量高于1×10⁵道尔顿的果胶质，其量在所述组合物与动物的组织或体液接触时有效地形成凝胶。

本发明还涉及制备本发明组合物的方法。一方面，本发明涉及制备用以在动物中持续释放生理活性剂的干燥组合物的方法，该方法包括将果胶质和生理活性剂的混合物溶于载体中以形成溶液或分散体，其中果胶质的量可以有效地在动物中原位形成凝胶；以及去除载体中的挥发性成分以获得干燥组合物。

本发明还涉及固体或液体药物组合物的施用方法，所述组合物在与动物的组织或体液接触时形成凝胶。一方面，本发明涉及下述方法，所述方法包括对动物的组织或体液以任意顺序或组合施用如下成分以在与动物的组织或体液接触时形成凝胶：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；

b.包含具有阴离子羧酸酯或硫酸酯基团的亚单元的一种或多种多糖；和

c.一种或多种固体的凝胶诱导性组合物，该组合物包含一种或多种二价或多价金属阳离子的药学可接受的盐。

在以上描述的实施方式中，所述a、b和c组分可以以任意顺序施用，而且a和b组分可以是固体或液体溶液的形式，以及a、b和c组分的任意组合或亚组合可以同时施用或以混合物的形式施用。

本发明还涉及与动物的组织或体液接触时可以凝胶化的液体组合物，以及将所述组合物应用于组织和体液的方法。一方面，本发明涉及将生理活性剂施用于动物的方法，该方法包括：

a)提供液体溶液或分散体，所述液体溶液或分散体含有

i)液体载体，

ii)果胶质，该果胶质的甲基化程度低于30％且平均分子量大于4.6×10⁵道尔顿，其含量为当将所述液体溶液或分散体应用于动物的组织或体液时可以有效地形成凝胶的量，和

iii)将所述液体溶液或分散体应用于动物的组织或体液，以在接触所述组织或体液时形成包含生理活性剂的凝胶。

另一方面，本发明涉及用于动物鼻粘膜施用的包含粉末颗粒的疫苗组合物，所述粉末颗粒包含以下物质的纳米级分散体：

a)有效诱导动物免疫应答的量的一种或多种抗原，和

b)一种或多种凝胶或其单价阳离子的盐，该凝胶或其所述的盐的甲基化程度低于约30％并且平均分子量高于约1×10⁵道尔顿；

其中所述粉末颗粒可通过网孔直径约为250μm的网筛。

在一些其它方面，本发明涉及将固体或液体形式的疫苗组合物施用于动物或人的方法，该方法包括将疫苗组合物施用于动物或人的粘膜表面。一方面，本发明涉及给动物接种疫苗的方法，该方法包括如下步骤：

a.提供一种或多种包含可通过网孔直径约为250μm的网筛的粉末颗粒的粉末组合物，并且该粉末组合物包含

i)具有甲基化程度低于约30％且平均分子量高于1×10⁵道尔顿的果胶质，该果胶质的量为当所述组合物与动物粘膜表面接触时可以有效地形成凝胶的量；

ii)选自肽、蛋白、核酸、碳水化合物、活细胞或微生物或死细胞或微生物或其部分、或病毒或其部分的一种或多种抗原，该抗原的量为能够在动物中诱导主动免疫应答的量；

b)将所述粉末施用于动物的鼻组织(nasal tissue)和/或鼻液(nasalfluid)，以在与组织或体液接触中形成凝胶，和

c.诱导动物对一种或多种抗原产生主动免疫应答。

在前述讨论中，概述了本发明某些更为相关的特点。这应当理解为仅仅阐明了本发明的某些更为显著的特点和应用。因此，通过参考以下详述，可以更充分地理解本发明。

为了更彻底地理解本发明的优选实施方式，以下提供了结合有附图的详细说明，其中相同的数字代表相同的要素。

附图说明

图1是显示NaCl与芦荟果胶的钙凝胶化之间关系的柱状图。

图2显示在正常动物血清中，不同浓度的芦荟果胶的原位凝胶化。

图3A显示存在HEC增稠剂时，在正常动物血清中，芦荟果胶的原位凝胶化。

图3B显示存在藻酸钠增稠剂时，在正常动物血清中，芦荟果胶的原位凝胶化。

图4显示利用小的有机化合物(坚牢绿)，芦荟果胶原位凝胶化所获得的缓释效果。

图5显示在确定范围内，体现bFGF处理和细胞数目之间关系的柱状图。

图6显示坚牢绿从液体或干燥剂型中释放的速率。图6a显示LM果胶的结果，图6b显示LMW芦荟果胶的结果。

如实施例17所描述，随着时间的推移，测量置于正常牛血清中的剂型周围的分散圆周的直径。

图7显示了蛋白质从包含高分子芦荟果胶并悬乳于模拟鼻液中的粉末剂型中的控释释放，如实施例20所描述。

图8显示了将粉末疫苗剂型对小鼠进行经鼻输送后，抗DT-CRM抗原的特异性血清IgG应答，如实施例22所描述。

图9显示了外源钙的加入所获得的果胶剂型在与正常小牛血清接触时的原位凝胶化的增加，如实施例24所描述。

图10显示了在鼻内输送HMW芦荟果胶溶液(0.5％，w/v)4小时后的小鼠鼻腔系列横切片，该切片显示鼻粘膜表面的凝胶形成，如实施例26所描述。

图11显示了小鼠对经鼻施用液体疫苗组合物所产生的血清IgG和肺IgA免疫应答，如实施例29所描述；其中所述组合物包含芦荟果胶和蛋白抗原(DT-CRM)(a和b)或灭活流感裂解(split)亚病毒体抗原(A/NewCaledonia/20/99，H1N1)(c和d)。

具体实施方式

通过参考本发明下述的各种实施方式和其中包括的实施例的详细描述并参考附图及其之前和之后的描述，可以更容易地理解本发明。在公开和描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应该理解，除非特别说明，本发明并不局限于特定的原料、药物试剂或特定合成方法，因为这当然可以进行改变。还应理解，此处使用的术语只是为了描述特定的实施方式而并非为了进行限定。

定义

在此处描述的说明书和配方中，定义了以下术语。

“可选择的”或“可选择地”的意思是指随后描述的事件和情形可以发生，也可以不发生，因而该描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，术语“可选择的赋形剂”的意思是指赋形剂可以包含也可以不包含在组合物中。

必须指出的是，如说明书和所附的权利要求所使用的，除非上下文另有明确表示，否则单数形式的“一个”、”一种”和“所述”包括了复数形式。因此，例如，“一种芳香族化合物”包括了芳香族化合物的混合物。

通常，本文将范围表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定的值。当表达这种范围时，另外的实施方式包括从所述一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当一个值通过前面的“约”来表达近似值时，应当理解所述特定值构成另一个实施方式。进一步地，应当理解，每一个范围的端点相对于另一个端点均具有显著不同，并独立于另一个端点。

“药学可接受的”意指并非为生物学不合需要的或其它不合需要的材料，即可以将所述材料与相关的活性化合物施用于个体而不引起临床不可接受的生物影响或者不以有害方式与包含所述材料的药物组合物所含有的其它成分互相作用。

此处提供的术语“有效量”的化合物是指所提供的化合物的量足以对所需功能进行所需调节，所述的功能例如基因表达、抗原诱导免疫反应、蛋白功能或疾病条件。如下面所指出的，所要求的确切量因受试对象的不同而不同，这取决于受试对象的种类、年龄和一般条件、被治疗疾病的严重程度、所使用的特定试剂及其施用方式等。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，合适的有效量可通过本领域的普通技术人员利用常规实验来确定。

本文所示定义和使用的术语“凝胶”是指包含有机聚合物分子的多孔性三维网络的弹性固体或可变形的半固体，所述网络中含有可逆吸收的液体。在本发明的上下文中，可逆吸收的液体虽然可以包含其它液体材料，但通常包含液态水。在本发明的上下文中，聚合物分子的网络通常包含具有羧酸酯或硫酸酯基团的重复单元的多糖，包括果胶。在本发明的许多实施方式中，至少一些邻近的多糖链的羧酸酯或硫酸酯基团与二价或多价阳离子例如钙离子或铝离子配位，形成基本上不溶于纯水的多糖分子的阳离子交联的三维网络。这种阳离子交联和水不溶性凝胶的存在和确定通常可通过实验来证实，即首先将凝胶试样置于纯的中性水中数小时，以确认它们保持半固体形式并且基本上不溶于水，但通过添加金属阳离子螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐来去除二价或多价金属离子而诱导凝胶快速溶化。

本文使用的术语凝胶化是指交联聚合物网络的形成以及液体和/或其它材料被吸收到交联聚合物网络中，以形成基本上不溶于本体液体的固体或半固体的凝胶。原位凝胶由合适的前体聚合物和通常包括水的液体所形成，当其与组织或体液或模拟的组织或体液接触时或之后产生交联，从而形成含有交联的聚合物网络和来自组织或体液的水的固体或半固体。

“聚合物”是指多于10个的二价或多价的亚单元(通常称为单体)通过共价健连接在一起而形成的大分子。本发明的聚合物包括天然聚合物例如蛋白、核酸、多糖等，所述聚合物可以含有相对大量数目的不同类型的单体，或者为聚丙烯酸酯等通常仅含有一种或少数几种不同单体的人工合成的聚合物。

“凝胶化诱导剂”是能够引起聚合物或聚合物溶液形成凝胶的试剂。凝胶化诱导剂通常通过诱导聚合链之间的交联来诱导凝胶的形成，在本发明的上下文中，其包括可以使相同或不同多糖分子上的羧酸酯或硫酸酯取代基团交联的二价和多价阳离子盐。

“离子聚合物”是合成的或天然的聚合物，该聚合物具有下述单体，所述单体具有离子化或易于离子化的功能基团(例如羧酸或相应的羧羧酸酯基团，或有机磺酸及其相应的有机磺酸酯的阴离子基团)。

“离子移变凝胶”是聚合物与离子交联形成的凝胶。

“干燥药物制剂”是指以粉末、小压块(pad)、膜剂、海绵状物、片剂或胶囊形式存在的水分含量低于20％的干燥药物剂型。

“粉末”是主要包含极小的固体颗粒或球体的固态干燥材料。粉末的颗粒或球体的本体最大尺寸低于1毫米。在以上定义的上下文中，“干燥”意指在粉末颗粒或球体的表面几乎没有自由流动液体或过量湿气(包括水)，而如果在其表面存在有自由流动液体或过量湿气，则会具有显著抑制粉末的正常的自由流动物理特性的倾向。本发明的粉末实际上可以包含吸收至它们的颗粒或聚合物网络内的水分，但在其表面不含有显著量的可流动液态水。

“微球体”是小的具有通常为连续弯曲且无角的表面的大致为球形的固体颗粒，所述颗粒的有效直径为约0.1μm～约250μm(微米)。本文所定义的微球体包括微胶囊。“微粒”则与微球体相反，具有平坦的、有角的、菱形或不规则表面。微粒的最长线性长度为约0.1μm～约250μm。

“生理活性剂”是指可以在动物体内诱导生理反应的试剂、化合物或组合物。生理活性剂包括营养物质、小分子药物和治疗剂、大分子药物和治疗剂、药学活性物质、诊断剂、治疗剂、核酸、肽、聚合物、小蛋白、大蛋白和活细胞。药学活性物质包括可引发免疫应答的物质，例如含有一种或多种抗原的疫苗。治疗试剂的例子包括抗菌物质、抗微生物试剂、抗寄生物试剂、抗生素、抗组胺剂、减充血药、抗代谢药、抗青光眼剂、抗癌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗炎药、抗糖尿病药、麻醉剂、抗镇静剂、止痛剂、抗凝血剂、眼药、血管生成因子、免疫抑制剂以及抗过敏药。

“疫苗”包含一种或多种抗原，其形式通常为蛋白、肽、碳水化合物、脂或核酸，或为完整的活的或死的细胞或微生物或其部分、完整的病毒或其部分等，其能够诱导被处理哺乳动物的免疫应答，经常诱导抗体的形成(体液免疫应答)和/或细胞(T细胞)的免疫应答，所述应答选择性针对所述抗原或产生抗原的微生物或组织，据此治疗或预防由微生物、病毒和/或癌症引起的疾病。

本发明所使用的术语“果胶质”包括主要部分为一种或多种来自天然果胶的多糖物质的任何物质。果胶质包括低甲氧基的和高甲氧基的果胶、脱酯化果胶、果胶钙凝胶、芦荟果胶钠凝胶、果胶酸、果胶酸盐、果胶酯酸、果胶酸盐(pectinate)、原果胶和诸如芦荟内凝胶(Aloe vera innergel)细胞壁纤维等富含果胶的物质，上述物质可以是其单独形式或全体形式或组合形式。如上所讨论的，果胶是所述复合胶体碳水化合物衍生物的总称，其存在于植物中或从植物中制得，并且含有很大比例的半乳糖醛酸酐单体单元。

“脱酯化”果胶是多数甲酯基团已由人工加工从果胶聚合物中去除的果胶。

“果胶酸”是适用于对主要由胶体状多聚半乳糖醛酸组成且基本不含有甲酯基团的果胶质的总称。完全脱酯化的果胶是果胶酸或多聚半乳糖醛酸。“果胶酸盐”是果胶酸的正盐或酸性盐。“果胶酯酸”是含超过可以忽略比例的甲酯基团的胶体状多聚半乳糖醛酸。“果胶酯酸盐”是果胶酯酸的正盐或酸性盐。“原果胶”是指植物中存在的不溶于水的原始果胶，一旦发生限制性水解，其即产生果胶、果胶酸及其它物质的原始果胶。不溶于水的果胶与植物中存在的纤维素有关，如芦荟内凝胶或外皮细胞壁纤维。

说明书和所附的权利要求书所使用的化学物质的残基是指结构性片段或部分，其为由特定反应路线所获得的化学物类、随后得到的制剂或化学产物，而不管该结构性片段或部分是否是真的由所述化学物类得到。因此，果胶中的Gal A残基是指果胶中的半乳糖醛酸(galuronic acid)单体重复单元，而不管半乳糖醛酸本身是否存在于果胶中或用以制备果胶。

在下面的描述中，经常提及单位“％(w/v)”。“％(w/v)”表示在100ml液体溶液中的物质克数。在稀释的水性溶液中，液体的密度约为1克/毫升，因此“％(w/v)”约等于100克液体中的固体物质的克数。在这些“％(w/v)”单位中，如1％(w/v)的溶液将对应于1克/100毫升，即＝1g/100ml＝10mg/ml。

本文使用的缩略词包括：

CMC，羧甲基纤维素；Da，道尔顿；DM，甲基化程度；Gal A，半乳糖醛酸；HEC，羟乙基纤维素；HM，高甲氧基；HPMC，羟丙基甲基纤维素；kDa，千道尔顿；LM，低甲氧基；PBS，磷酸盐缓冲的盐水；PEG-PLGA-PEG，聚乙二醇-聚(乳酸-共-羟乙酸)-聚乙二醇；PEO-PLLA，聚环氧乙烷-聚(L-乳酸(lactide))；PEO-PPO-PEO，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷。

用于原位成胶的药物组合物

本发明的药物组合物是液体形式或固体形式的“原位”成胶组合物，其包含一种或多种阴离子多糖和一种或多种生理活性剂，其中，在施用到动物的组织、体液或粘膜表面时或之后的短时间内，组合物中的阴离子多糖通常通过形成多孔三维聚合物网络而形成原位凝胶。在将所述组合物施用于动物的组织、体液或粘膜表面之前，本发明的药物组合物及其大部分或所有的组分在将其施用于组织和体液之前通常可溶于纯水，但其具有一个显著的特性，即一旦将其施用于体液组织，阴离子多糖的羧酸酯或硫酸酯基团即与从生物流体中吸收来的“内源的”二价钙通过配位形成足够的交联，从而形成生理条件下实际上不溶于水或体液的生物粘附性凝胶。因此，本发明的组合物与现有技术中的组合物有明显区别，现有技术中的组合物含有先前即已交联而在施用后并没有进一步交联的聚合物组合物。

在本发明凝胶的上下文中，聚合物网络孔隙中的液体通常包括水、生理盐水或来自被治疗动物或患者的含有水的生物流体，并且药物或药学活性物质也通常被截留在交联聚合物网络的孔隙中。在本发明的说明书中，凝胶网络通常通过邻近多糖分子中的阴离子羧酸酯或硫酸酯基团之间的配位/离子键以及通过使与羧酸酯或硫酸酯基团配位的二价或多价阳离子交联而形成。

固体组合物

在一些实施方式中，本发明涉及用于将生理活性剂输送到动物中的固体药物组合物，该组合物包含：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；

b.包含具有阴离子羧酸酯或硫酸酯基团的亚单元的一种或多种多糖；以及

c.一种或多种固体的多糖凝胶诱导性组合物，该组合物包含一种或多种二价或多价金属阳离子的药学可接受的盐；

其中所述药物组合物为固体形式，当与动物的组织或体液接触时形成凝胶。

在与上述组合物有关的另一实施方式中，本发明涉及用于将生理活性剂施用到动物中的组合物，该组合物包含：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；和

b.甲基化程度低于约30％且平均分子量高于约1×10⁵道尔顿的一种或多种果胶质，

其中所述药物组合物为固体，当与动物的组织或体液接触时形成凝胶。

上述固体药物组合物可以是任何固体形式的固体，包括小压块、片剂、胶囊或粉末。在许多实施方式中，所述固体药物组合物被制成粉末形式。

在另一个相关实施方式中，本发明涉及用于给动物经鼻施用的疫苗组合物，该疫苗组合物包含粉末颗粒，所述粉末颗粒包含以下物质的纳米级分散体：

a.有效诱导动物免疫应答的量的一种或多种抗原，和

b.一种或多种果胶或其单价阳离子盐，该果胶及其所述盐甲基化程度低于约30％且平均分子量超过约1×10⁵道尔顿，

其中所述粉末颗粒可通过网孔直径为约250μm的网筛。

所述粉末可以如本文其它地方所定义的，以多数的微粒和/或微球体存在。实际上，具有所需粒径范围的粉末可以通过本领域公知的许多方法中的任何一种来获得，包括乳化法、胶囊化法、喷雾干燥法、研磨或粉碎固体法等。在许多方法的最后步骤中，可以将前体固体或粉末通过一套或多套网筛。这种网筛的筛孔具有确定的和所需的规格，例如250μm、200μm、150μm、100μm、80μm、60μm、50μm、40μm、30μm、20μm、11μm、10μm、9μm、5μm、1μm和0.1μm，因而可以制备含各种粒径范围的粉末、微粒和/或微球体。所需粒径范围可包括下表1所列出的大致粒径范围。在一个实施方式中，网筛的筛孔允许粉末、微粒或微球体通过从而获得约等于或小于250μm的粉末、微粒或微球体。可选择地，可用另一种具有更小网孔直径的网筛来对粉末进行加工，以去除最小的颗粒，从而制备具有例如约11μm～约250μm粒径的固体组合物。

对粒径分布进行其它限制也是有利的。因而，在一些实施方式中，特定百分比的固体组合物中的颗粒落入特定的大小范围内。例如可以期望约80％、或约85％、或约90％、或约95％的颗粒落入特定的粒径范围内。作为一个例子，在一些实施方式中，本发明的固体组合物包含微球体，并且低于90％的微球体的直径介于0.1μm～10μm之间。

在本发明的一些实施方式中，生理活性剂沉积于包含离子多糖的颗粒和/或其它固体成分的表面上，或者将包含生理活性剂的粉末与包含离子多糖的粉末混合。然而，在本发明的许多实施方式中，生理活性剂优选高度分散于含有阴离子多糖、增稠剂、赋形剂等的混合物的固体基质中。优选地，在固体基质混合物中，该混合物中的各种成分在分子水平上主要以单个分子和/或离子混合物分散，尽管同样分子(尤其是有机盐)的一些较大规则聚集体也可能存在。这种半均质固体基质混合物可以称为该固体混合物的成分的“纳米级分散体”。甚至更优选地，固体混合物成分及其组成分子在分子水平上基本均匀分散为固体混合物成分的“固溶体”。这种“纳米分散体”和“固溶体”使敏感生物活性剂具有优异的稳定性，并通常改善了生理活性剂的分散性，控制了释放速度和/或生物利用度。

表1用于本发明凝胶形成组合物的成分的选择性组合范围^*

干燥制剂(％w/w) 液体制剂

多糖

0.0001％～99％ 0.001～20(％w/v)

0.001％～50％ 0.01～10

0.005％～20％ 0.05～8

0.01％～10％ 0.1～4

药物活性剂

0.0001％～90％ 0.001～50(％w/v)

0.001％～约70％ 0.01～25

0.01％～50％ 0.05～10

0.1％～20％ 0.1～8

粉末、微球体或微粒的粒径

0.1μm～300μm n/a

1μm～200μm n/a

10μm～100μm n/a

12μm～60μm n/a

15μm％～50μm n/a

干燥制剂(％w/w) 液体制剂

药学可接受的增稠剂

0.01％～90％ 0.01～10(％w/v)

0.1％～80％ 0.1～8

1.0％～70％ 0.2～6

5.0％～50％ 0.5～5

药学可接受的赋形剂

0.1％～90％ 0.1～40(％w/v)

1.0％～50％ 0.5～30

2.0％～30％ 1.0～20

3.0％～20％ 2.0～10

二价或多价金属阳离子

0.01％～80％ 0.00001～0.05(％w/v)

0.05％～40％ 0.0001～0.02

0.1％～10％ 0.001～0.01

^*尽管上表成对显示，但本文明确表示，针对表中列举的特定种类成分所列举的任何端值可以和针对该种类成分所列举的任何其它相应端值组合，以形成该种类成分的新范围。

本发明所采用的一种或多种多糖可以是中性或阴离子性的，这是因为所述多糖包含具有阴离子羧酸酯或硫酸酯基团的单糖亚单元。应该理解，阴离子羧酸酯基团可以为与单体亚单元相结合的羧酸盐形式或处于原羧酸本身的形式，其在生理pH易于离子化或已经离子化。类似地，单糖亚单元的阴离子硫酸酯基团包括含有磺酸基团的单糖的盐和含有硫酸盐的酸形式的单体亚单元。各种多糖包含阴离子羧酸酯或硫酸酯基团，所述多糖包括羧化淀粉、果胶质、藻酸盐、角叉胶或结冷胶。

在许多实施方式，所述固体药物组合物包含一种或多种果胶，该果胶为酸的形式或为羧酸的盐的形式。在许多更优选实施方式中，所述阴离子多糖和/或果胶以单价阳离子盐的形式存在，所述阳离子包括在生理pH易溶于水的锂离子、钠离子、钾离子和/或铵离子(NH₄ ⁺)。

果胶具有由鼠李糖残基间隔的α-(1→4)连接的多聚半乳糖醛酸(GalA)多糖聚合物骨架。Gal A残基具有附着于糖环上的羧酸酯取代基，其可以为羧酸或其盐或其酯的形式。大部分果胶的Gal A含量约70％～75％，而鼠李糖残基含量通常小于2％。鼠李糖残基与骨架中的Gal A残基以α-(1→2)连接，并在骨架链上诱导T形纽结，使多糖链更具有可挠性。中性糖侧链连接在骨架中的鼠李糖残基的O-3或O-4位置上，因而鼠李糖残基倾向在骨架上集聚在一起。因此，将包含具有侧链的区域的这些鼠李糖称为该果胶的“多毛区(hairy region)”，而将长段的重复而没有支链的Gal A残基称为该果胶的“光滑区(smooth region)”。

糖环上的羟基和/或羧酸取代基也经常连接到诸如甲基和乙酰基等非糖成分。鼠李糖的插入程度和对链及其单体的修饰依果胶的植物来源的不同而不同。甲基化发生在Gal A残基的羧基上，由此可形成羧酸甲酯。果胶的甲基化或甲酯化的程度(“DM”)被定义为被甲醇酯化的羧基(Gal A残基)的百分数。根据所述DM，可以将果胶分为两类，即DM小于50％的低甲氧基(“LM”)果胶和DM大于50％的高甲氧基(“HM”)果胶。通常来自于柑橘和苹果的大部分天然果胶和大部分商购果胶属于HM果胶。

LM果胶一般通过人工化学或生物化学脱酯化方法由HM果胶得到。商购的LM果胶中，DM通常为20％～50％。完全脱酯化的果胶被称为“果胶酸”或“多聚半乳糖醛酸”。酸形式的果胶酸是不溶性的，但盐形式的果胶酸是可溶的。果胶酸的常见盐形式是钠盐或钾盐。

果胶通常在pH约为3～4的酸性范围内最为稳定。pH低于3时，甲氧基、乙酰基和中性糖侧链通常脱去。在中性和碱性时，已知Gal A残基的甲酯基通常被皂化为羧酸或羧酸酯形式，但多聚半乳糖醛酸(polygalacturonan)骨架也在甲基化的Gal A残基的非还原性末端上通过糖苷键的β-消除-裂解而断裂，结果是LM果胶的分子量通常显著低于原始HM果胶的分子量。由于果胶酸和LM果胶仅有有限数目的甲酯基团或根本没有甲酯基团，因此一旦形成，果胶酸和LM果胶在中性和碱性条件下对分子量降低具有相对较高的耐受性，因而对聚合物链β-消除-裂解会减慢。

HM果胶和LM果胶均可形成凝胶。然而，这些凝胶形成的机理完全不同(Voragen等，In Food polysaccliarides and their applications.第287～339页，Marcel Dekker，Inc.New York，1995)。HM果胶在高浓度的共溶质(例如蔗糖)存在时在低pH下形成凝胶。HM果胶通常不与钙离子或其它多价离子反应，因此不象LM果胶那样形成钙凝胶(上文)。然而，某些HM果胶采用嵌段形式脱酯作用而具有钙反应活性，同时还具有大于50％的DM。参见Christensen等的美国专利No.6,083,540。

已知具有高百分比的未酯化羧酸和/或羧酸盐基团的LM果胶在足够高的钙阳离子浓度存在下形成凝胶。据认为钙离子与Gal A聚合物亚单元的阴离子羧酸盐配位，因而称其为“具有钙反应性”。据信钙-LM果胶凝胶网络通过形成一般所说的“蛋箱(egg-box)”结合区来构成，在所述的“蛋箱”结合区域内，Ca⁺⁺使沿两段互补的多聚半乳糖醛酸聚合物链上的互补羧酸酯基团发生配位和交联。钙-LM果胶凝胶的形成受几个因素的影响，包括果胶的DM、离子强度、pH和分子量(Gamier等，CarbohydrateResearch 240，219～232，1993；256，71～81，1994)。目前商购的LM果胶的分子量通常为7×10⁴Da～14×10⁴Da，并且Gal A的含量为约75％(Voragen等，In Food polysaccharides and their applications.第287～339页，Marcel Dekker，Inc.New York，1995)。典型果胶的鼠李糖含量为小于2％。

果胶一般用于食品工业，并被美国食品及药物管理局(FDA)归类于“GRAS”(一般认为是安全的)。长期以来，果胶也被用作胶体剂(colloidal agent)和止泄剂。近来，果胶也应用于医疗设备和药物输送(Thakur等，Critical Reviews in Food Science & Nutrition 37，47～73，1997)。在药物输送的情况中，已经发现在将口服药物输送到结肠中的多种试验配方中都采用了果胶，这是因为果胶易被存在于肠的所述区域的细菌分解。果胶或者不经凝胶化而直接使用，或者在施用前预先形成果胶钙凝胶以包覆药剂。参见Ashford等，J.Controlled Release 26，213～220，1993；30，225～232，1994；Munjeri等，J.Controlled Release 46，273～278，1997；Wakerly等，J.Pharmacy & Pharmacology 49，622～625，1997；International Journal of Pharmaceutics 153，219～224，1997；Miyazaki等，International Journal of Pharmaceutics 204，127～132，2000。

在一些实施方式中，果胶的甲基化程度(DM)等于或低于约70％、50％、30％、25％、20％、19％、18％、15％、14％、12％、10％、9％或5％。甲基化程度的降低通常(但并不总是)改善凝胶化特性，但是还有许多其它因素影响果胶的凝胶化特性。

果胶质或果胶的分子量对于其凝胶化特性是一个重要因素，高分子量通常获得更佳的凝胶化。美国专利5.929,051描述了分子量在果胶的凝胶化中的重要性，在此通过参考的方式而将其引入本文中，该专利作为整体教导了果胶和芦荟果胶的特性。在许多实施方式中，果胶质或果胶的平均分子量大于约4.6×10⁵道尔顿，或约5.0×10⁵道尔顿。或者，果胶质或果胶的平均分子量等于或小于约2×10⁵道尔顿、3×10⁵道尔顿、4×10⁵道尔顿、6×10⁵道尔顿、7×10⁵道尔顿、8×10⁵道尔顿或9×10⁵道尔顿。在一些实施方式中，果胶质或果胶的分子量大于1×10⁶道尔顿，并且甲基化程度低于10％。

采用本发明的一些优选的果胶，例如从DelSite Biotechnologies Inc，获得的芦荟果胶和/或它们的水溶性单价阳离子盐，可以获得带有0.5％(w/v)LM果胶和30mg/g～60mg/g的Ca²⁺的坚实而具有弹性的凝胶。

本发明的固体组合物，尤其是含有下述果胶的组合物，可以包含少量的水，所述果胶倾向于吸附有残余水。因此，本发明的固体组合物可包含约等于或低于20重量％的水，或约等于或低于15重量％、12重量％、10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、5重量％、3重量％、2重量％、1重量％的水。任何上述的含水百分率的颗粒通常可以描述为“干燥”，其含义是在颗粒表面没有过多的自由流动液体或湿气而引起显著影响固体以粉末形式自由流动的显著粘性。在本发明的某些实施方式中，低重量百分比的水是优选的，以便在贮藏过程中改善生理活性剂的稳定性或改善固体的物理特性。

活性物质

如在本文其它地方所定义的术语，本发明组合物(液体或固体)可以含有一种或多种生理活性剂。在一些实施方式中，生理活性剂可以包括治疗剂、诊断剂、碳水化合物、脂、肽、核酸、活细胞、完整的死细胞或其部分，完整的微生物或其部分、完整的病毒或其部分、疫苗、抗原及蛋白。本发明的组合物可以包含诸如小分子药物等治疗剂。本发明的许多实施方式的组合物可以包含多种较大的生物制剂，包括分子、细胞、病毒、抗原等。

在一些优选实施方式中，所述生理活性剂是用于制备疫苗的抗原，包括肽、蛋白、活细胞、完整的死细胞或其部分、完整的病毒或其部分、灭活细菌或病毒、活的减毒细菌或病毒、噬菌体、亚单位疫苗蛋白、亚单位疫苗肽、亚单位疫苗碳水化合物、复制子、病毒载体、质粒，以及其它免疫活性遗传或重组材料，或其组合。在一些实施方式中，所述一种或多种抗原独立选自用于预防流感、白喉、破伤风、百日咳、SARS、AIDS、霍乱、志贺氏菌病、脑膜炎、鼠疫、肝炎、登革热、黄热病、脑炎、疟疾、疱疹、麻疹、伤寒症、肺结核、斑疹伤寒症、耳炎、炭疽病的抗原或其组合。

在一些实施方式中，所述一种或多种抗原是用于流感的抗原或其组合，例如，诸如一种或多种灭活或减毒的流感病毒(完整病毒体)，或其亚单元(断裂病毒体、亚病毒体)，诸如一种或多种病毒膜糖蛋白，诸如红血球凝聚素(HA)或神经氨酸酶(NA)，或诸如核壳体蛋白等病毒内在蛋白或其混合物。目前，断裂亚病毒体或亚单位抗原在流感疫苗制备中使用最为广泛。典型的流感病毒的例子是前些年在预定人群中流行的两或三种病毒株，使其在胚胎性鸡蛋中生长，并从尿囊液中收获，或使其生长在某些动物细胞系例如MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞中，用化学试剂如甲醛灭活，并纯化获得经纯化的完整病毒。完整的灭活或减毒的病毒可用于制备完整的病毒体疫苗，或经纯化的病毒可通过化学物质断裂以将其分成亚成分，如膜蛋白HA和NA及其各种已知的亚型，然后可将该蛋白抗原进行进一步纯化。一株或多株病毒来源的抗原可以组合产生最终的疫苗。

对于许多亚病毒体流感病毒而言，流感疫苗的剂量通常根据HA含量来制备。优选地，用于流感的所述一种或多种抗原存在于所述的组合物中和/或以能够在哺乳动物或人中诱导≥40的红血球凝集抑制(HAI)滴度的量施用于患者。用于经鼻施用的粉末流感疫苗组合物通常可配制为用于单次施用的每剂粉末包含约5微克～50微克来自三种目前流行的病毒株的HA。

疫苗抗原与基于蛋白和其它生物材料的药学活性剂通常存在于本发明组合物中或通过本发明的方法以显著低于其它人工药物或治疗剂的浓度例如以微克水平施用。在动物中能够诱导医学可接受水平的免疫应答所需的疫苗抗原的量当然会因动物的种类和体重以及哺乳动物和/或个体的特定类型的免疫系统特性不同而不同。然而，仅为示例目的，所述一种或多种抗原可以以组合物重量的约0.001重量％～约重量10％，或约0.01重量％～约1％，或约0.05重量％到约0.5重量％的量存在于组合物中。

本发明采用的生物试剂在贮藏中和施用过程中以及施用之后明显不如其它材料稳定。本发明的组合物在所述生物材料的稳定化和贮藏方面具有预想不到的优越性。特别地，当与合适的凝胶化多糖尤其是果胶混合，并干燥形成固体时，固体组合物中的多糖和其它载体和/或赋形剂的极性特性以及固体组合物中的低水含量可显著延长在室温或甚至在冷藏条件下贮存于水性溶液中都不稳定的生物分子的保存期。此外，在施用到组织或体液之后，大的生物试剂一旦结合到原位凝胶中，则倾向于被多糖基质所稳定，并且从凝胶中释放的趋势要比较小的化合物慢，从而可获得较高的生物利用度并具有所需的缓慢释放速率。本发明组合物的这些所需要的特性在疫苗和相关抗原的施用中尤其重要。

另一个方面，本发明涉及将生理活性剂输送到动物中的方法，该方法包括将以下成分以任何顺序或组合施用到动物的组织或体液中，以在与动物的组织或体液接触时形成凝胶：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；

在本实施方式以及本发明固体组合物的其它实施方式中，包含一种或多种二价或多价金属阳离子的药学可接受的盐的固体的凝胶诱导性组合物作为化学独特固相(chemically distinct solid phase)存在，组合物中可选择地存在生理活性剂和/或其它固体赋形剂，或存在生理活性剂和/或其它固体赋形剂的混合物。所述固体的凝胶诱导性组合物的目的是提供凝胶诱导性的二价或多价阳离子的“外源”辅助性固体源，以补充从施用位点的组织或体液中可原位获得的凝胶诱导性的二价或多价阳离子，从而诱导和/或改善凝胶形成的速度和/或效率。

固体的凝胶诱导性组合物的二价或多价阳离子通常以二价或多价阳离子盐的药学可接受的形式存在，当其与体液接触后，可提供阴离聚合物凝胶化所需要的二价或多价阳离子的辅助来源，以便快速而有效地使邻近多糖链的阴离子基团交联，从而改善所需要的凝胶化倾向，或降低形成凝胶所需的阴离子多糖的浓度。药学可接受的钙盐和铝盐优选用作固体的凝胶诱导性组合物的一部分。

在一些实施方式中，二价或多价阳离子的药学可接受的盐易于溶于水、生理盐水或体液(例如血清或粘膜分泌液)中。在与体液接触后，二价或多价阳离子的药学可接受的可溶的盐迅速溶解而将阳离子释放到水性介质中，并快速扩散到与阴离子多糖例如果胶接触的溶液中，与阴离子基团配位而使阴离子多糖交联。所述二价或多价阳离子的易溶的盐的例子包括卤化钙，尤其是氯化钙。

在另一个实施方式中，二价或多价阳离子的药学可接受的盐在生物流体的水性环境中不易溶解，按Merck Index的术语上来说在体液中“实际上是不溶的”。所述难溶的二价或多价阳离子的药学可接受的盐优选在环境温度和生理pH不溶于水，不形成任何所含的盐超过5×10^-3摩尔/升的溶液，或更优选难溶性的盐不超过1×10^-5摩尔/升。二价或多价阳离子的难溶的药学可接受的盐的例子包括磷酸钙和氢氧化铝。

在包含所述二价或多价阳离子的难溶的药学可接受的盐的本发明组合物中，阴离子多糖倾向扩散到所述难溶性盐的固体颗粒的表面上，并与颗粒表面上的二价或多价阳离子反应，使凝胶倾向于在固体的凝胶诱导性组合物颗粒的表面上形成。因此，固体的凝胶诱导性组合物的包涵体(inclusion)倾向于引起含有生理活性剂的阴离子多糖在组织表面上或粘膜表面上与其中分散着的众多固体的凝胶诱导性组合物的颗粒形成凝胶化聚集体。所述凝胶化聚集体可以提供比不包含固体的凝胶诱导性组合物的组合物更优异的生物粘附性，并且由于存在高于正常情况的二价或多价阳离子浓度，因此凝胶对溶解的耐受性更强，使包覆在凝胶中的生理活性剂倾向于获得出乎意料地慢的优越的释放。

在上述方法中，组分a、b、c可以以任何顺序、任意组合或任意物理形式进行施用，只要组分c以固体形式施用并且在与液体的组织或体液接触后形成凝胶即可。在所述方法的一些实施方式中，组分a、b、c以粉末组合物组分施用，其中所述组分可以为一种或多种固相的物理混合物形式。在一些实施方式中，固体组分c作为包含粉末颗粒的独特固相存在，而在其它实施方式中，固体组分c也可以在分子水平上与生理活性剂以混合物的形式存在。

在一些实施方式中，组分a和b作为分开或混合的粉末而施用，而组分c以不同的且为化学单独的(distinct)固相的形式存在。例如，组分a和b可以作为含有组分a的一种或多种粉末和含有组分b的一种或多种粉末的物理混合物施用，所述物理混合物可以与组分c分开或一起施用。

在一些优选实施方式中，组分a和b以固体组合物的方式进行施用，所述固体组合物通过下述方法制备：在液体载体中溶解一种或多种生理活性剂和一种或多种多糖，然后除去足量的液体载体以形成固体混合组合物，其中所述试剂和多糖在分子水平上紧密地混合。组分c可在所述固体混合组合物施用之前、施用的同时或施用之后施用，其通常以粉末的形式施用。

如上所述，本发明的一些实施方式涉及用于将疫苗和/或抗原施用于动物和/或人的组合物和方法。因此，在一些实施方式中，本发明涉及将疫苗施用于动物的鼻粘膜的方法，该方法包括将下述组分施用于动物的粘膜表面：

a)含有微球体或微粒的一种或多种粉末，所述粉末分开或合并包含

i)包含具有阴离子羧酸酯或硫酸酯基团的亚单元的一种或多种多糖，所包含的量为当所述组合物与动物粘膜表面接触时可以有效形成凝胶的量；

ii)一种或多种抗原，所述抗原选自肽、蛋白、核酸、活细胞、死细胞或其部分、或病毒，所述抗原的量为在动物中可以诱导主动免疫应答的量；以及

b)将粉末施用于动物的鼻组织和/或鼻液(nasal fluid)，使其在与组织或体液接触时形成凝胶；以及

c)诱导动物对一种或多种抗原产生主动免疫应答。

液体组合物

在一些实施方式中，组分a和b以液相载体中的溶液的形式施用，而组分c作为分开的固体施用。

在另一个实施方式中，本发明涉及将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括：

a)提供一种液体溶液或分散体，所述液体溶液或分散体包含：

i)液体载体，

ii)果胶质，其甲基化程度低于30％且平均分子量高于4.6×10⁵道尔顿，且其含量为当将所述液体溶液或分散体施用于动物的组织或体液时可使所述溶液或分散体有效地形成凝胶的量，以及

iii)一种或多种生理活性剂；和

b)将所述液体溶液或分散体施用到动物的组织或体液中，从而使所述溶液或分散体与组织接触时形成含有生理活性剂的凝胶。

在施用液体组合物的上述方法的一些实施方式中，果胶质可以是芦荟果胶，其优点已有描述。在施用液体组合物的上述方法的相关实施方式中，生理活性剂是诸如肽、蛋白、抗原、疫苗、活细胞、完整死细胞或其部分，或者是完整病毒或其部分等生物制剂。在相关的实施方式中，组织或体液可以是粘膜表面，包括鼻腔粘膜表面。

在施用液体组合物的上述方法中，组合物可以通过某些试剂进行改进从而改善所述组合物的贮藏特性。如在实施例25和其它地方所进行的进一步描述，可以将诸如氯化钠和/或氯化铵等单价阳离子的盐或诸如磷酸盐缓冲剂等缓冲剂加入到液体组合物中，以提供生理pH和离子强度的溶液。此外，当首先将所述溶液进行贮藏然后再施用生理活性剂时，所述溶液具有某些意想不到的优越特性。如果以合适的浓度将NaCl或NH₄Cl加入到含有所述的果胶和活性剂的液体溶液中，当冰藏(约4℃)时，所述溶液能可逆地形成凝胶。所形成的凝胶可具有稳定性并能保护敏感的生物活性剂，使之免于沉淀和/或衰变。当将组合物从贮藏条件中取出以施用于动物或人时，凝胶溶解，形成清澈且无沉淀的溶液，该溶液适合于通过注射而施用于粘膜表面等。

此外，如实施例24所述，可以将少量的二价阳离子的盐添加到液体溶液中而无需使它们凝胶化，其优点是，当将所述经改进的溶液应用于组织或体液时，可以促进原位凝胶化。

另外，如本文其它地方所述，所述液体溶液可以包含其它增稠剂和/或赋形剂。

经鼻施用疫苗特别令人感兴趣的原因是这种施用具有很多优点。经鼻给药通常避免了与注射有关的不舒适感和成本，而且还避免了消化道中的酸和酶对敏感抗原的破坏作用。还已知的是，身体保持有独特的全身和粘膜免疫系统，而粘膜免疫系统对于抵抗许多传染性疾病的负面影响是非常重要的。在许多情况下，抗原的经鼻给药可以同时刺激全身和粘膜免疫系统的免疫反应。然而，已知鼻粘膜在很短时间内本身会快速复原和清除外源试剂，因此疫苗的经鼻给药可能具有挑战性。因此，许多现有技术试图通过将疫苗经鼻施用，但没有获得治疗上的成功，这是因为疫苗组分很快从鼻粘膜上清除而没有足够的时间保持接触以有效地诱导动物产生所需水平的免疫应答，尤其是在诸如蛋白等高分子量和高极性抗原的情况中。

本发明提供了意想不到地克服了现有技术中问题的组合物及所述组合物施用方法，其是通过提供形成含有粘附到鼻粘膜表面的抗原的原位凝胶的组合物并提供延长疫苗的抗原组分的滞留时间来实现的。参见实施例26和图10。如实施例22和图8所示，其结果是动物中主动免疫应答的诱导得到了意想不到的改进并且非常良好。

在许多实施例中，通过测定动物的肺部冲洗液(lung washing)中IgA水平，与施用不含多糖的对照组合物的对照实验所获得的IgA水平相比，将疫苗和/或抗原施用于动物的鼻粘膜后，动物的免疫应答增加约10％。优选地，通过测定动物的肺部冲洗液中IgA水平，与施用不含多糖的对照组合物的对照实验所获得的IgA水平相比，动物的免疫应答增加超过约25％、50％、75％、100％、150％或200％。

认识到含有凝胶形成性离子聚合物的粉末剂型的一个独特优点在于将所述粉末剂型与干燥的凝胶诱导剂混合以确保在施用后形成一致的(consistent)凝胶的能力。因而，可以将制成干燥粉末的凝胶诱导剂添加到粉末剂型中。由于诱导试剂呈干燥状态，因而在输送或水合之前不会形成凝胶。在输送之后，凝胶诱导剂溶解，进而通过与凝胶化离子聚合物相互作用，促进粉末剂型颗粒的凝胶化。

对于诸如果胶、藻酸盐、聚磷腈(polyphosphazene)等聚合物，凝胶诱导剂可以是各种二价、三价和其它多价金属离子。这些离子的例子包括钙、锌、镁、铁和铝。可以将它们本身制成粉末或在赋形剂存在的情况下将它们制成粉末。可以调整所述诱导剂粉末颗粒的密度和规格，以便与活性剂配方粉末以均匀一致的方式进行混合。

赋形剂和辅剂

此外，也可以使用其它的药学可接受的赋形剂，包括粘合剂、填充剂或膨胀剂、滑润剂、调味剂、味道掩饰剂。粘合剂用于产生不流动(free-glowing)的粉末；填充剂用于增加粉末的体积；滑润剂用于增加粉末的流动性；味道掩饰剂用于减少药物不愉快的味道。

一种优选的药学可接受的赋形剂是药学可接受的单糖或二糖或其混合物，或其烷基化、羟基烷基化或酰化的衍生物。所述单糖或二糖通常是无毒的和/或被归类为“一般认为是安全的”，易于溶于水或生物流体，并且便宜。所述药学可接受的单糖或二糖的例子包括核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、和海藻糖。优选的药学可接受的单糖或二糖的子集包括果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和海藻糖。乳糖尤其是它的一水合物是优选的赋形剂。

药学可接受的单糖或二糖可以以任意的浓度存在，但在一些实施方式中以相对较高的浓度存在，即组合物重量的约10.0重量％～约99.9重量％，或优选约30重量％～约99.5重量％，或优选约50重量％～约99.5重量％，或约80重量％～约99.5％。当单糖或二糖以相对较高浓度的固体组合物形式存在时，所得颗粒粉末的颗粒在与体液或粘膜表面接触时，在成胶前倾向于部分溶解或部分崩解。单糖或二糖易于快速溶解或吸收，使活性剂和/或果胶或其它阴离子多糖的浓缩粘稠并具有生物粘附性的凝胶残留物充分地分散并粘附到生物表面例如粘膜表面上。

上述单糖或二糖在本发明组合物中作为赋形剂的用途对用于以低浓度经鼻施用的疫苗抗原和其它生物学活性剂的微粒和/或微球体粉末剂型的形成特别有利。单糖或二糖作为赋形剂、稀释剂和/或膨胀剂而存在，可允许将颗粒制成处于10微米～250微米范围内的相对较大的颗粒，已知对于所述颗粒范围，当将组合物以吹入法和类似技术进行施用时，大部分颗粒将沉积于鼻粘膜上，而在短时内单糖或二糖会溶解或被吸收，使含有生理活性剂的浓缩粘稠并具有生物粘附性的原位凝胶残留物充分地分散并粘附到生物表面例如粘膜表面上。

药学可接受的单糖或二糖尤其优选为固体形式的赋形剂，其中它们可以形成用于药学活性剂(特别是通常有些不稳定和通常以低浓度施用的诸如肽、蛋白、抗原等药学活性剂)的易溶于水的稀释剂和/或稳定剂。

本发明的组合物还可以包含一种或多种另外的药学可接受的辅剂或吸收促进剂或其混合物。辅剂是在剂型中用于改善或有助于基本药学活性剂的效力或活性的添加剂。对于疫苗组合物，辅剂改善患者对疫苗抗原产生的免疫应答。在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物包含一种或多种疫苗辅剂，该辅剂选自脂多糖、大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、单磷脂A(MPL)、皂草苷、胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)、细胞因子，以及它们的衍生物、铝盐、磷酸钙、碳酸钙及其混合物。

在将药物活性剂施用于粘膜表面尤其是鼻粘膜表面上时，若其中包含一种或多种吸收促进剂则可以作用于粘膜表面、细胞膜、或胞间连接从而改善所述活性剂的吸收。对于本发明组合物的粘膜施用，适当的吸收促进剂可以包括表面活性剂、粘液溶解剂、蛋白或核酸降解酶抑制剂、螯合剂(例如EGTA、EDTA)、酰基甘油、脂肪酸和盐、泰洛沙泊、水杨酸盐、胆盐及其类似物、羧链孢盐(fusidate)及其混合物。

芦荟果胶

根据最近美国专利5,929,051所描述，从芦荟植物中分离芦荟果胶，在此通过参考引入该专利的全部内容。芦荟果胶是天然的LM果胶，并且可钙凝胶化。此外，芦荟果胶可以具有几个独特的尤其涉及凝胶化的化学特性，包括高分子量(大于1×10⁶Da)、高Gal A含量(大于75％、80％、85％，并且很多情况下大于90％)以及低DM值(小于10％)。低于10％的DM几乎使芦荟果胶成为果胶酸，但其具有比其它商业可获得的低DM果胶和果胶酸显著高的分子量，例如实施例27、表8所示。芦荟果胶由于Gal A的含量高，因此聚合物中的羧酸酯基团的百分比也明显要高于其它果胶。芦荟果胶的多糖骨架还通常具有所需的高支化程度，并且由于其鼠李糖含量高，因而具有不同寻常的可挠性聚合物骨架，其中鼠李糖的含量可以大于3％或大于4％，而其它果胶约为2％。具有如此之低的DM、高分子量、高Gal A和鼠李糖含量的果胶在美国专利5,929,051之前还没有被描述过。芦荟果胶最近可以以适于药学应用的纯度通过商购获得，该果胶为乳白色粉末，并且最终商品可完全溶于水，而先前可商购获得的和/或实验LM果胶为黄色至棕黄色粉末，含有大量的不溶性物质，因而不是药物应用所需要的。

芦荟叶由两部分组成，即绿色外皮和也被称为浆液的纯净的内部凝胶。芦荟果胶是从内部凝胶或外皮细胞壁纤维中提取的。已经发现，采用微碱性pH值的螯合剂的方法是最有效的提取方法。与此前所述的果胶相比，芦荟果胶是独特的。芦荟果胶的提纯制剂中鼠李糖的含量大于4％，比其它果胶例如柑橘、苹果、制糖甜菜和向日葵果胶所记载的鼠李糖含量高出至少2倍。鼠李糖是果胶骨架中的关键糖，其含量影响分子的可挠性。芦荟果胶还含有稀有的糖，即3-甲氧基(Ome)-鼠李糖，这在任何其它果胶中均未记载过。芦荟果胶天然就是低甲氧基，其DM通常小于30％，还可低至小于10％。芦荟果胶的Gal A含量大于70％，还可高达大于90％。芦荟果胶可以在钙存在时形成凝胶。一价阳离子如钠、钾和锂可以促进凝胶的形成。

可以根据以下一种或多种特征将芦荟果胶与其他果胶区别开来：

1.高分子量(大于1×10⁶Da)和高内在粘度(大于550ml/g)；

2.高鼠李糖含量(大于4％)；

3.高半乳糖醛酸含量(大于90％)；

4.含有3-甲氧基-鼠李糖；

5.是天然LM果胶，其DM低至小于10％；

6.能够形成钙凝胶；

7.能够在低温(4℃)下形成基于一价阳离子的凝胶。

本发明人发现，通过采用体内注射或在创伤表面局部涂敷作为给药途径，未凝胶化的果胶能够在给药部位原位形成凝胶。该原位凝胶是牢固的且不会流动，正如在体外形成的钙凝胶一样，这明显不同于粘性的但仍为流动溶液的水凝胶。已发现，芦荟果胶原位形成凝胶特别有效，原位形成牢固的固体凝胶所需要的芦荟果胶浓度可低至2.5mg/ml或0.25％w/v，如果加入增稠剂，该浓度还可更低。

此外，单价阳离子形成凝胶的能力可以有利地应用于制备含有敏感性生物分子的组合物中，该组合物包含钠和/或铵的氯化物，在生理pH值和离子强度下能够在冷藏时能可逆地形成凝胶，因而能够形成凝胶以使敏感的生物活性剂稳定化。如实施例25所述，如此配制的凝胶当返回室温后溶解，形成清澈和无沉淀的液体药物组合物。重新溶化的溶液可通过各种施用方法施用于组织或体液以形成原位凝胶。

凝胶组合物可被制成等压或等渗的，并可调节其pH值至哺乳动物的体液如眼泪的pH值。这类体液的pH值和渗透压分别为7.4和29mOsm/kg(毫渗透压摩尔/千克)。在例如符合体液的pH值和渗透压的条件下，有利于将药学活性剂输送到哺乳动物身体需要进行药物处理的部位。可选择性地，在消毒条件下提供本发明的药物组合物。

尽管不希望受到任何理论的约束，但据信果胶的原位凝胶化主要受到体液中钙离子的介导。血液的钙浓度为8.5mEq/dl～10.3mEq/dl(毫当量/分升)。NaCl也是体液的一种常见组分，在NaCl存在的条件下，果胶的钙凝胶得到了加强。血液中含有134mEq/L的NaCl。

在以下多种试剂存在的条件下也可以在皮下注射后原位形成凝胶，所述试剂包括小分子有机化合物、蛋白质、核酸、活细胞及其他聚合物。这表明果胶能够通过胶囊或裹夹的形式输送多种药剂。当含有难溶性的化合物如磺胺嘧啶银时，仍可原位形成凝胶。给药之后，果胶原位凝胶立即表现出明显的缓释效果。在体外和体内条件下采用小分子有机模型化合物(坚牢绿)证实了这一点。此外，当bFGF与果胶原位凝胶一同给药时，观察到该凝胶周围的细胞增殖有了明显的增加。

芦荟果胶在原位凝胶化方面比现有的商品果胶更为有效，所述商品果胶包括LM果胶、多聚半乳糖醛酸和酰胺化LM果胶。只有当商品多聚半乳糖醛酸或LM果胶的浓度高于芦荟果胶的10倍时，商品多聚半乳糖醛酸或LM果胶才能够形成良好的原位凝胶。现有的商品LM果胶和多聚半乳糖醛酸的Gal A含量较低(约75％)，其分子量要小得多(7～14×10⁴Da)，而且其DM为15％～50％。还有其他一些聚合物能够形成钙凝胶。其中的一个例子是藻酸盐，而先前不相信藻酸盐能够在所测试的浓度形成严格规定的原位凝胶。藻酸盐是一种多糖嵌段共聚物，其由古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)组成(Moe等，In Food polysaccharidesand their applications，287～339，Marcel Dekker，Inc.New York，1995)。藻酸盐中的这两种残基以G-链段、M-链段或交替的MG-链段存在。只有G-链段与钙凝胶的形成有关。根据来源的不同，总的G含量有很大不同。G含量最高约为70％。此外，生理性液体中的NaCl抑制藻酸盐钙凝胶的形成。

已经发现，几种其他一些聚合物也能原位形成凝胶。然而，为了原位形成凝胶，它们大多需要高的聚合物浓度(大于20％)(泊洛沙姆、PEO-PLLA二嵌段共聚物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物、纤维素和乙酰邻苯二甲酸乳胶)。这些聚合物中有些不能生物降解，例如泊洛沙姆，或者在施用前需要控制温度(PEO-PLLA二嵌段共聚物)，或者在配制过程中需要控制温度(普鲁尼克和Gelrite)。热凝胶聚合物(泊洛沙姆、普鲁尼克、PEO-PLLA二嵌段共聚物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物和基质胶)的缺点是在包装或贮存中的周围温度变化会使其在施用前发生凝胶化。此外，这类聚合物中许多仅形成水凝胶，水凝胶是粘性但仍能流动的溶液(例如泊洛沙姆和普鲁尼克)。另外，为了发生凝胶化，这些聚合物很多只形成具有粘性但仍为流动溶液的水凝胶(例如泊洛沙姆和普鲁尼克)。此外，有些聚合物配方为了发生凝胶化而需要两种不同的聚合物或需要施加第二组分。果胶，特别是芦荟果胶比这些聚合物或组合物有利，原位形成凝胶所需要的聚合物浓度很低(约0.25％w/v)，如果加入增稠剂，该浓度还可更低。其制备无须控制温度或pH值，也无须加入第二组分来使其原位发生凝胶化。所得的凝胶是透明的，而且当果胶浓度超过一定浓度范围时，不会象PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物和普鲁尼克那样使凝胶的浊度显著上升。

生物技术的发展产生了越来越多的基于蛋白质的疗法。蛋白质本身是不稳定的。合适的配方和输送方法对于其在体内的功效非常关键(Langer，Nature 392，5～10，1998；Putney和Burke，Nature Biotechnology16，153～157，1998)。由于果胶的凝胶化条件比较温和，因此果胶原位凝胶特别适合于输送蛋白质。许多蛋白质试剂也希望以缓释的方式局部给药，例如，用于伤口愈合的生长因子和用于治疗性的血管生长的血管生长因子。这也可通过原位形成果胶凝胶来实现。当采用芦荟果胶原位凝胶输送bFGF时，观察到凝胶周围的细胞增殖有了显著的增加。

以最终的组合物或制剂的重量计，生理活性剂的含量可以在从约0.01％～约大于90％的范围内变化。生理活性剂的用量取决于其类型、形式和特性而变化。

以组合物的总重量计，果胶质可在约0.01％～约40％的范围内变化，优选为约0.1％～约20％，更优选为约0.25％～约2％。果胶质的用量取决于生理活性剂的类型、形式和特性。选择性地，也可采用载体或赋形剂。

本发明所用的载体包括任何药学可接受载体，例如，水、生理盐水、缓冲的水性溶液、诸如油/水乳液等乳液、辅剂、润湿剂、片剂和胶囊。以最终的组合物或制剂的重量计，载体可在从约0％～约90％内变化。载体的用量取决于生理活性剂以及所述组合物或制剂的给药方式。

代表性的缓冲剂包括碱金属或碱土金属的碳酸盐、氯化物、硫酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、硼酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐和/或氯化铵。代表性的防腐剂包括亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸盐、苯扎氯铵、氯丁醇、乙基汞硫代水杨酸钠、硼酸苯汞、对羟基苯甲酸酯、苄醇和苯乙醇。

因而，本发明的一个实施方式提供了用来持续释放生理活性化合物的组合物，所述组合物含有果胶和生理活性化合物，且含有或不含药学可接受的增稠剂。优选地，给动物身体施用所述组合物后，所述组合物由液体变为凝胶，从而使生理活性化合物持续释放或控释释放。

可以在所述配方中加入可生物降解的增稠剂例如聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)、羧甲基纤维素(“CMC”)、羟乙基纤维素(“HPMC”)、藻酸钠、胶原蛋白、白明胶和透明质酸。这类增稠剂的加入不但不影响如下所述的凝胶效果，而且提供了如下优点，即增加了凝胶基质强度，以及可在低果胶浓度下原位形成凝胶。此外，也可使用使pH值、离子强度和温度发生变化的聚合物，只要它们能够与果胶凝胶产生协同作用即可。此外，可以在存在或不存在增稠剂的条件下采用不同果胶的混合物。其他增稠剂包括卡波普、Gelrite、壳聚糖和木葡聚糖。以最终的组合物或配方的重量计，所述增稠剂可在从约0％～约90％的范围内变化。所用的可生物降解的增稠剂的量取决于生理活性剂以及所述组合物或配方的使用方式。

本发明的另一个实施方式提供了一种用作医疗用具(medical device)的组合物，所述组合物含有果胶且含有或不含药学可接受的增稠剂。

优选所述果胶质具有钙反应性，其中果胶的半乳糖醛酸单体亚单元上的羧酸酯取代基团可与钙离子配位而形成钙交联的凝胶。这种钙反应性凝胶的形成可通过各种分光光度计和/或湿化学方法(wet chemicalmethod)来确定，包括将交联凝胶与钙螯合剂(例如乙二胺四乙酸及其盐(EDTA))反应，所述钙螯合剂可用于从凝胶中去除配位的钙，进而导致凝胶的溶化。

更优选所述果胶质是LM果胶或多聚半乳糖醛酸。进一步优选所述果胶质是芦荟果胶。

可以采用多种方法将含有一种或多种治疗剂或诊断剂的原位凝胶化的果胶组合物施用或输送至动物。例如，可将药物局部施用至眼睛、粘膜表面或伤口局部。也可通过诸如经皮下、肌肉内或经腹膜内注射等以肠胃外的方式进行施用。还可将药物注射到器官、关节腔或肿瘤内。

可以从多种植物来源提取果胶。除柑橘和苹果外，还可以从例如土豆、葡萄、制糖甜菜和向日葵籽获得果胶。可以对果胶进行改性。例如用氨处理果胶可以得到酰胺化的果胶。可以想象，类似于芦荟果胶的果胶可存在于不同种类的植物中，或者为了增强果胶原位凝胶化的能力，根据本文所公开的原则，可以一定方式对来自不同植物源的果胶进行制备、再加工和/或改性。此外，尽管DM小于50％的LM果胶因具有钙反应活性而被本发明优选采用，但是，某些HM果胶也以已知对钙敏感且能够形成钙凝胶，因此它们也可用来原位凝胶化(Tibbits等，Carbohydrateresearch 310，101～107，1998)。此外，还可以采用嵌段形式的脱酯HM果胶，此类果胶的DM仍大于50％，但通过嵌段形式的脱酯化反应已经被赋予了对钙的敏感性。参见Christensen等的美国专利No.6,083,540。

因此本领域的技术人员应当理解，以上述公开的具体实施方式为基础，可以对其他用来实现与本发明目的相同的结构容易地进行修改或设计。本领域的技术人员应当认识到，这类等同的结构没有偏离所附权利要求的精神和范围。

实施例1

芦荟果胶的原位凝胶化

芦荟果胶的提取

由芦荟叶的浆液或外皮制备细胞壁纤维，从该细胞壁纤维中提取芦荟果胶。提取果胶的基本方法已有报导。见Voragen等，In Foodpolysaccharides and their applications，第287～339页，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1995，另见美国专利No.5,929,051，本文在此特地引用其全文供参考。采用螯合剂如EDTA或在包括热水、热稀酸(HCl，pH 1.5～3)以及冷稀碱(NaOH和Na₂CO₃；pH10)等其他条件下提取芦荟果胶。

初提之后，通过粗滤和精滤除去残余的纤维。用乙醇沉淀果胶。用乙醇溶液进一步洗涤所述果胶沉淀，然后干燥。

由该方式得到的来自浆液或外皮细胞壁纤维的芦荟果胶的特征是：分子量大于1×10⁵Da，DM低(小于50％)，Gal A含量大于80％。优选所述分子量大于1×10⁶Da，DM小于10％并且Gal A含量大于90％。

采用基于HPLC(高效液相色谱)的尺寸排阻色谱法以支链淀粉为基准物测定分子量。通过选择性还原法(Maness等，AnalyticalBiochemistry 185，346～352，1990)和基于HPLC的方法(Voragen等，Food Hydrocolloids，1，65～70，1986)测定DM。采用间羟基联苯法(Blumenkratz，N.和Asboe-Hansen，G.，Analytical Biochemistry 54，484～489，1973)测定Gal A含量。在此全文引用上述三篇文献供参考。

通过体内注射施用的芦荟果胶溶液的原位凝胶化

首先将芦荟果胶溶解于无菌的去离子水中，然后使之与等体积的2×生理盐水(0.3M的NaCl)混合。芦荟果胶可能不易溶于盐溶液中。然而，果胶一旦溶于水中，就能够与盐溶液混合，从而得到生理离子强度。以这种方式得到的生理盐水中的果胶溶液仍然是澄清的。室温下果胶溶液可自由流动，根据聚合物浓度的不同，该果胶溶液的pH值为5.0～6.0。如无特别说明无需调整温度和pH值。根据动物使用规程，在SwissWebster小鼠的下腹部皮下注射该制剂(0.05或0.1ml/部位)。注射后经过不同的时间杀死小鼠，检测凝胶的形成情况。

对于施用生理盐水的对照组，其注射部位的皮肤肿胀长时间不消退。当用外科方法切开注射部位的皮肤时，发现有一块球形或椭圆形凝胶。该凝胶是清澈透明，而且是稳固的。该凝胶很容易与周围的组织分离开来。用外科方法将该凝胶连同皮肤切除下来，将其在福尔马林中固定，制成切片，用H&E染色，在显微镜下观察。该凝胶仅被轻微染色，但是清澈可见，被皮肤组织包裹。在大鼠中也观察到了相同的原位凝胶化。大鼠的注射部位的肿胀不如小鼠明显，因为大鼠的皮肤较厚且被毛皮覆盖。然而，当采用外科方法将注射部位切开时，观察到了同样的原位形成的凝胶。对于大鼠，可以在其下腹部皮下注射1毫升芦荟果胶溶液，而相应地得到了明显较大的凝胶块。

凝胶的形成受果胶浓度的影响。果胶浓度约为0.25％(w/v)时，得到坚固的固体凝胶，而在约0.1％(w/v)下没有观察到凝胶的形成。在0.1％到0.25％的浓度之间得到软凝胶。

当用稀氢氧化钠把芦荟果胶溶液的pH值调节至为约7.2时，也形成了原位凝胶。

原位凝胶化的能力依赖于芦荟果胶的分子量。当采用分子量很小(约3×10⁴Da)但其DM和Gal A含量相同的芦荟果胶时，在0.5％(w/v)下测试没有发现原位凝胶化。

通过腹膜和肌肉内途径注射之后也形成了原位凝胶，但所形成的凝胶看上去不象皮下注射之后所形成的凝胶那样均一。

实施例2

在伤口表面局部给药之后的原位凝胶化

将生理盐水中的芦荟果胶制剂(0.5％，w/v)直接涂敷到小鼠或大鼠皮肤上割伤的整个创面。采用生理盐水中含有0.5％(w/v)CMC的制剂和商购的水凝胶创伤敷料作为对照。按照动物使用规程，采用活体冲击法形成创伤。4小时后，杀死大鼠，用外科手术方法取下创面。在福尔马林中固定创面，然后切片，用H&E染色。采用芦荟果胶制剂在创面上明显地形成了凝胶层，而采用CMC的制剂和商购的水凝胶创伤敷料时则没有形成凝胶层。

实施例3

根据凝胶前沿迁移法(Gel Frontal Migration Assay)检测由体液中钙离子介导的果胶原位凝胶化

诸如血液、泪液、肺部液体和鼻分泌液中含有钙离子(例如血液中为8.5～10.3mEq/dl)。由于芦荟果胶形成钙凝胶，所以通过采用动物血清测定体外凝胶形成来模拟凝胶的原位形成，从而检测钙在芦荟果胶的原位凝胶化中的作用。这种体外测试方法被称为凝胶前沿迁移测试，其中，将动物血清置于玻璃管底部，将芦荟果胶溶液平铺在该血清的顶部(根据试验溶液与果胶溶液的密度关系，也可将果胶溶液置于管的底部)。采用组织培养级的正常小牛血清。将2毫升血清置于玻璃管底部(0.8×11cm)，并将1毫升果胶溶液(0.5％～0.75％，w/v)置于该血清顶部。

在接触线处(或溶液的界面)立即形成了凝胶，经过一段时间，凝胶相或凝胶的前沿逐步向上伸入果胶溶液中。在光源下观察时，由于上部的果胶相中形成的凝胶浑浊度增加，所以可将形成的凝胶与果胶溶液区别开来。而且，如果形成了凝胶，将管倾斜时界面不发生移动。在界面处形成的凝胶的厚度可随时间进行测定(这种计量以下称为“凝胶长度”)。

然而，如果首先用盐水或EDTA(二价阳离子的螯合剂)透析体液例如血清以去除溶液中的游离钙，或向血清中加入EGTA(钙离子的专用螯合剂)直至最终浓度为10mM，这时则没有观察到凝胶的形成。这表明体液中的钙离子参与了果胶的原位凝胶化。

与体内实验类似的，当采用经过肝素化的小鼠全血或从其中所分离的血浆时，也发生了果胶的原位凝胶化。

实施例4

果胶与其他体液的原位凝胶化

除了血清或血液之外，还有许多其他类型的含钙体液，例如泪液、肺部液体和鼻液。为了测定果胶在体外是否也与其他体液也发生原位凝胶化，采用实施例3所述的凝胶前沿迁移测试法以及芦荟果胶(0.25％的盐水溶液)。

采用正常的腹膜液，可观察到凝胶化的发生。在此情形下，将为了制备单克隆抗体而注射了杂交瘤细胞的小鼠的腹水作为腹膜液。

用模拟的体液，也观察到了凝胶化的发生。所述模拟的体液是：

1.泪液(每100ml含有0.68g NaCl、0.22g NaHCO₃、0.008g CaCl₂2H₂O和0.14g KCl。参见Stjernschantz和Asitin，in Edman，P.(编)，“Biopharmaceutics of Ocular Drug Delivery”，CRC Press，Boca Raton，第1～15页，1993。或者，每100ml含有0.268g牛血清白蛋白、0268g溶菌酶、0.134g球蛋白、0.008g CaCl₂ 2H₂O、0.650g D-葡萄糖和0.658g NaCl。参见Cohen等，Journal of Controlled Release 44，201～208，1997)；

2.肺部液体(每100ml含有0.01g MgCl₂ 6H₂O、0.61g NaCl、0.03gKCl、0.027g Na₂HPO₄ 7H₂O、0.007g Na₂SO₄、0.018g CaCl₂ 2H₂O、0.095g NaHC₂O₂ 3H₂O、0.26g NaHCO₃和0.01g Na₃H₅C₆O₇ 2H₂O。参见Fisher和Briant，Radiation Protection Dosimetry，53，263～267，1994)；和

3.鼻分泌液(每100ml含有0.867g NaCl、0.44g Na₂HPO₄、0.108gNaH₂PO₄、0.058g CaCl₂ 2H₂O、0.31g KCl和0.636g白蛋白。参见Lorin等，Journal of Laboratory Clinical Medicine，2，275～267，1994)。

实施例5

NaCl促进果胶的钙凝胶化

血液和泪液等体液中也含有钠离子(血液中含有135～146mEq/L)。已经发现NaCl可促进LM果胶的钙凝胶化。通常，在缓冲或未经缓冲的生理盐水(0.15M NaCl)或等渗溶液中制备局部或肠胃外施用的药理学制剂。

为了确定对于芦荟果胶是否也发生NaCl溶液诱导的凝胶化的促进，采用了凝胶前沿迁移测试法。将在0.15M NaCl(2ml)中制备的芦荟果胶(0.5％，w/v)溶液置于管的底部，再将密度稍低的100mM CaCl₂溶液(0.05ml)置于所述果胶溶液的顶部。经过一段时间，所形成的凝胶向下延伸到果胶溶液内。加入CaCl₂后间断地测量凝胶前沿向果胶溶液的迁移。结果显示，在NaCl存在下凝胶前沿的迁移较快，即NaCl的存在促进了芦荟果胶的钙凝胶化(图1)。NaCl的效果还与其剂量有关；在0.15M的NaCl中比在0.05M的NaCl中凝胶形成的速度快。

这些研究结果与此前关于其他LM果胶的研究结果一致(Garnier等，Carbohydrate Research 240，219～232，1993；256，71～81，1994)。图1是NaCl与芦荟果胶的钙凝胶化的关系的柱状图。

实施例6

在低的果胶浓度下果胶的原位凝胶化较快

采用上述的凝胶前沿迁移测试法。将在盐水(1ml)中不同浓度的芦荟果胶加到正常小牛血清(2ml)上。室温下18小时后，测定所形成的凝胶的长度(即凝胶的厚度)。不论果胶浓度如何，在接触相都能起始凝胶化。然而，不同的果胶浓度下在一段时间内凝胶长度的增长速度不同。发明人发现，果胶浓度越低，凝胶化速度越快；在0.05％(w/v)下所形成的凝胶长度比在0.5％(w/v)下的长度大将近5倍(见图2)。在低浓度(小于0.2％，w/v)下所形成的凝胶要松软的多，强烈的搅动可将其破坏。

当采用氯化钙溶液替代血清时，也观察到了同样的结果。这表明在较低的果胶浓度下果胶的钙凝胶化速度增加了。

实施例7

其他聚合物或增稠剂的加入促进了果胶的原位凝胶化

采用上述的凝胶前沿迁移测试法。将羟乙基纤维素(HEC，0.45％，w/v)、羧甲基纤维素(CMC，0.45％，w/v)或藻酸钠(0.45％，w/v)等聚合物与芦荟果胶(0.05％，w/v)混合。尽管藻酸钠能够在体外条件下与CaCl₂溶液形成钙凝胶，但是藻酸钠不与血清原位形成凝胶。将1ml的聚合物溶液加到2ml的正常小牛血清上，用凝胶前沿迁移测试法进行测试。18小时后，测定所形成的凝胶的长度。结果显示，其他聚合物的加入没有影响果胶原位凝胶化的速度(见图3A和3B)。当将所述聚合物与芦荟果胶以不同比例(0.4％对0.1％)混合时也观察到了同样的结果。

在与实施例1所述类似的体内小鼠实验中，采用芦荟果胶(0.375％，w/v)和CMC(0.375％，w/v)在盐水中的混合物对小鼠进行皮下注射后形成了原位凝胶。此外，增稠剂(0.4％或0.3％(w/v)的藻酸钠或HEC)的加入使得在较低的芦荟果胶浓度(0.1％或0.2％，w/v)下即能原位形成较好的凝胶；而此时原位形成凝胶要么是松软的，要么不是用单独的芦荟果胶形成的(实施例1)。

实施例8

与其他果胶和藻酸盐的比较

使用了除芦荟果胶之外的其它几种能够发生钙凝胶化的多糖进行体内凝胶化实验。其它的多糖包括来自柑橘的DM为28％的LM果胶和由苹果果胶制得的多聚半乳糖醛酸(DM＝0)，该两者均从Sigma Chemical Co.获得；以及一种DM为28％～34％、DA(酰胺化度)为16％～22％的酰胺化果胶。使用前将其溶解于去离子水中，过滤并用乙醇沉析，然后干燥。

如实施例1所述，采用其它果胶的溶液通过皮下注射途径在小鼠上进行原位凝胶化实验。采用每个试样在两只小鼠的四个位点进行注射。结果显示，皮下注射之后，上述任意一种多糖在1.0％或1.65％(w/v)的浓度下，均没有清楚地观察到凝胶的原位形成，而是仅观察到有斑点状的凝胶物质。然而，当在较高的浓度(3.0％或3.3％，w/v)下进行试验时，采用多聚半乳糖醛酸和酰胺化的LM果胶均产生良好的凝胶。

类似地，实施例1中所述的低分子量的芦荟果胶在高浓度下(2.5％，w/v)也发生了原位凝胶化。

还试验了DM为64％的HM柑橘果胶。其制备方法与LM果胶的制备方法相同。HM果胶在3％(w/v)的浓度下没有观察到凝胶的形成。注射部位湿润且为水样，没有观察到固体凝胶块。

还试验了藻酸盐，包括浓度为0.5％的Keltone HVCR和G含量高的藻酸盐Manugel DMB(G含量，60％～70％)。皮下注射4小时后进行检测，仅发现了斑点状的凝胶物质，这表明大多数物质扩散掉了，没有发生凝胶化。采用上述的体外凝胶化试验(实施例7)进行测定，发现藻酸盐对于正常小牛血清也没有形成凝胶。综合这些结果表明，在相同浓度下，LM果胶、多聚半乳糖醛酸、酰胺化的LM果胶和藻酸盐比芦荟果胶原位凝胶化的效率低很多。

实施例9

通过果胶原位凝胶化输送生理活性剂

对于采用原位形成的凝胶输送药物来说，凝胶化必须在药物或诊断剂存在下发生。于是，在生理盐水中使各种化合物或试剂与芦荟果胶混合，使得最终的果胶浓度为0.5(w/v)。实验试剂包括小分子有机化合物(坚牢绿，N-Ethyl-N-(4-[(4-{ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]amino}phenyl]-(4-hydroxy-2-sulfophenyl)methylene)-2，5-cyclohexadien-1-ylidene)-3-sulfobenzenemethanaminium hydroxide inner salt，disodium salt，808Da，10mg/ml)、小蛋白(bFGF，17kDa，10μg/ml)、中蛋白(牛血清白蛋白，66kDa，10mg/ml)、大蛋白(I型牛胶原蛋白，2mg/ml)、核酸(λDNAHind III片段，200μg/ml)、聚碳酸酯(CMC，0.5％，w/v)和Raw 264.7细胞(小鼠的巨噬细胞系，1×10⁸/ml)。对小鼠皮下注射上述混合物。注射后4小时检测凝胶的形成。结果显示，与单独采用芦荟果胶进行的对照类似，在所测试的所有药剂存在下均形成了凝胶。

此外，通过凝胶前沿迁移测试，在以下物质存在下，0.5％(w/v)的芦荟果胶溶液也发生了原位凝胶化：1)0.1％(w/v)的磺胺嘧啶银，这是一种常用来处理伤口的难溶性的抗菌剂；2)0.5％(w/v)的羟乙基纤维素(HEC)；和3)0.5％(w/v)的藻酸钠(Keltone HVCR，Kelco)。如实施例6所述，0.5％(w/v)的HEC或藻酸钠的存在不影响原位凝胶化的效率。

于是，采用如此多种不同的药剂均发生了原位凝胶化这一事实表明，可以采用果胶原位凝胶来输送广泛种类的药剂。

实施例10

体外条件下小分子有机化合物从果胶原位凝胶中的缓慢释放

治疗剂和诊断剂的分子量变化很大，即从约100Da到超过10,000Da。通常，化合物越小，越难达到缓释效果。此处选用小分子有机化合物坚牢绿作为试验化合物，坚牢绿是广泛用于食品和制药工业的染料。在盐水中将该染料与芦荟果胶(0.5％，w/v)混合，使该染料的浓度为1mg/ml。将1mg/ml的仅含染料而无果胶的盐水溶液作为对照。将1毫升的染料/果胶制剂或对照物置于可透过12kDa馏分的透析管(直径为1cm)中。然后将装有试样的透析管置于30ml玻璃管中的25ml正常小牛血清中。在加入了染料/芦荟果胶溶液的一支血清管中再加入EDTA，直至最终浓度为10mM，以便阻止钙凝胶化的发生。在旋转振荡器上以100rpm的转速连续振荡装有试样的血清管。在不同的时间点取少量血清(100μl)作为试样。通过测定620nm的OD来确定释放到血清中的染料的量。采用血清试样和已知量的坚牢绿来建立标准曲线。结果显示，在所测定的各个时间点上，从对照和有EDTA的染料/芦荟果胶(未形成凝胶)释放出的坚牢绿的量近似，而从无EDTA的染料/芦荟果胶(形成凝胶)释放出的染料的量显著较低(p＜0.05；斯式t-检验(student t-test))(见图4)。这表明芦荟果胶的存在及其凝胶化显著降低了模型小分子药剂的释放速度。

实施例11

皮下注射后小分子有机化合物从果胶原位凝胶中的缓慢释放

为了测定上述观察到的缓释是否能在体内条件下实现，给小鼠皮下注射溶于生理盐水中的坚牢绿(1mg/ml)/芦荟果胶(0.5％，w/v)，或只注射溶于生理盐水中的坚牢绿。4小时后检测注射部位(每个试样两个部位)。结果发现在果胶存在的条件下原位形成了凝胶，该凝胶部分保持了染料，尽管颜色不如注射之前的初始制剂那样深。相反，对照的注射部位没有凝胶也没有颜色，因而也没有保持染料。因此，果胶原位凝胶保持了染料，并且事实上延缓了体内条件下的释放。

实施例12

通过芦荟果胶原位凝胶局部输送bFGF

对于在给药部位的周围组织上产生局部效果的生长因子而言，它们需要在基质中输送，以便使它们能够以缓慢或持续的方式而被释放。在这方面，单在盐水或缓冲液中进行输送并不有效。本实施例采用了生长因子(bFGF)。已知bFGF(基本纤维原细胞生长因子，或FGF-2)是一种已知能够刺激纤维原细胞增殖和血管生成或血管形成的生长因子。在生理盐水中将其与芦荟果胶(0.5％，w/v)混合，使得浓度为1μg/ml～10μg/ml，然后在小鼠下腹部的左侧或右侧皮下注射该混合物。其中一侧注射对照物(仅为果胶)，另一侧注射含有bFGF的制剂。在第5～10天从两只小鼠上连皮摘取原位形成的凝胶，并固定在福尔马林中，切片并用H&E染色。在凝胶的两端选择两个相同的区域，这两个区域垂直地位于凝胶表面与皮肤肌肉层之间，且从凝胶的侧端水平向内510μm，采用NIH成像软件对每个凝胶的这两个选定区域的细胞进行计数。结果显示，用bFGF处理过的细胞数目比对照物的细胞数目高出2倍(图5)。而且观察到bFGF浓度高(10μg/ml)时凝胶周围的血管形成增加了。这表明bFGF从原位形成的凝胶中释放出来，并在周围的组织中发挥了其功能。

实施例13

干燥的果胶组合物的原位凝胶化

在水中制备芦荟果胶与CMC(各为0.75重量％)的混合物和1.5％CMC，分别将上述混合物于称量盘中冻干。将干燥材料切成小圆块(直径约1cm，厚度约3mm)，然后浸入装有10ml正常小牛血清的培养皿中。芦荟果胶/CMC小圆块形成了一种清澈的凝胶，该凝胶在试验结束后4天仍保持完整，而仅含有CMC的小圆块在同样条件下在几个小时内就被溶解或消失了。因此，该结果表明，干燥状态的果胶在浸入体液后也能形成凝胶。

实施例14

果胶原位凝胶在药物输送中的用途：配制方法

可以采用果胶原位凝胶来提供一种生理上可接受的组合物，其含有治疗剂或诊断剂以及低浓度的凝胶聚合物(果胶)，所述组合物具有与体液相同的pH值和渗透压，并在施用后可由液体转变为凝胶。

制备液体制剂的方法包括如下步骤：

1.将果胶溶解于无菌水中；

2.制备缓冲的或非缓冲的盐水；

3.混合所述两种溶液；

4.将生理活性化合物加入到步骤3的制剂中。作为替代方法，也可将生理活性剂加入混合之前的任一溶液中。

除了水和缓冲或非缓冲的盐水或水性溶液之外，还可以使用其他药用载体，其中包括乳液如油/水乳液、辅剂、各种类型的润湿剂、片剂和胶囊。

采用适当的缓冲剂如硼酸-硼酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、和Tris-HCl等来调节该制剂的pH值。用盐例如NaCl、KCl和MgCl₂以及其他渗透压调节剂如山梨醇、蔗糖、甘油和甘露醇等来调节制剂的渗透压，以模拟体液的渗透压。

可以加入药学可接受的增稠剂。增稠剂可以是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、改性纤维素聚合物例如羧甲基纤维素(CMC)、羟甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、藻酸盐、白明胶、葡聚糖、环糊精或透明质酸。

该制剂可以在室温或冷藏(4℃)条件下保存。如果该制剂含有约0.15M的NaCl，则当其在4℃贮存时会形成(钠)凝胶。施用前，可以将凝胶在室温下复原为溶液。对于易于发生聚集、或具有低水溶性的药物或治疗剂颗粒例如磺胺嘧啶银等，保存在凝胶基质中是有利的，这是因为凝胶可以阻止凝聚或沉淀的形成。

作为替代方法，也可以将制剂制成干燥形式。将果胶和生理活性剂在缓冲或非缓冲的水或盐水中的混合物冻干。作为替代方法，也可将果胶粉末与干燥的生理活性剂混合后压缩为所需的形状。干燥形式可以用作小压块、片剂、胶囊或粉末。

在制剂或组合物中，生理活性剂和果胶质的相对量可以根据所需输送的特定药剂而有很大的不同。在液体配方中，药剂可在约0.01％～约50％(w/v)的范围内，而果胶质可在约0.01％～约40％(w/v)的范围内。在干燥的或悬浮的配方中，药剂或果胶质均可高达90％(w/w)以上。

实施例15

含有多种(Assorted)阴离子多糖的药物粉末剂型的制备以及它们凝胶形成特性

制备含有如表2所示的模型活性剂、各种阴离子多糖、增稠剂和可选择性加入的赋形剂的粉末剂型。制备剂型所用的离子聚合物如下所列。

高分子量芦荟果胶(HMW AP)，DM＜10％，Mw＞1.0×10⁶Da

低分子量芦荟果胶(LMW AP)，DM＜10％，Mw＝1.3×10⁵Da

多聚半乳糖醛酸(Poly Gal A)，来自Sigma，DM＜3％，Mw＝1.7×10⁵Da

低分子量果胶(LM果胶)DM＝26％，来自Sigma，Mw＝2.0×10⁵Da

藻酸盐，中等粘度，来自Sigma Chemical Co.。

通过尺寸排阻色谱法以支链淀粉作为基准物，按实施例10所描述的美国专利5929051的方法测定分子量。采用TSK-Gel G5000 PWX柱(TosoHaas)进行SEC。用0.05％(w/v)叠氮化钠在水溶液中制备0.3mg/ml的试样。50μl的试样用于注射，用0.05％(w/v)叠氮化钠以1ml/min进行洗脱。按顺序测定折射率。以支链淀粉(4.04×10⁵、7.88×10⁵和1.66×10⁶Da)为基准物。采用标准线性回归线计算出分子量。

目前商业获得的芦荟果胶是高度纯化且经微过滤的芦荟果胶，采用cGMP(current Good Manufacturing Practice)制造。上表列出的其它多糖均含有大量的不溶物质，并且当溶于水中时产生不清澈溶液。它们也通过微过滤去除不溶物质，并用乙醇沉淀，用前干燥。牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶最初用作药物活性剂。BSA作为模型药剂，广泛用于检测各种药物制剂，尤其是用于蛋白质输送的药物制剂。溶菌酶是已知的具有抗菌特性的酶。

聚烯吡酮(povidone)(聚乙烯吡咯烷酮，K29-32)用作增稠剂，乳糖用作赋形剂，它们均从Sigma Chemical Co.获得。

通过制备表2所列的所有成分的液体混合物，然后将溶液冻干，形成冻干固体来制备成粉末剂型。

液体前体溶液和最终粉末的组合物如表2所示。

表2

试样组合物液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)^*
试样组合物液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)^*					1	2	3	4	5
多聚物聚烯吡酮乳糖活性剂(BSA或溶菌酶)	HMWAP0.4(0.03)7.5(57.69)5(38.46)0.1(0.0077)	LMWAP0.8(0.06)7.5(56.39)5(37.59)0.1(0.075)	LM果胶0.8(0.06)7.5(56.39)5(37.59)0.1(0.075)	多聚半乳糖醛酸0.8(0.06)7.5(56.39)5(37.59)0.1(0.075)	1	2	3	4	5	藻酸盐0.8(0.06)7.556.395(37.59)0.1(0.075)

^*括号中的数字表示干燥形式中各成分的百分含量(w/w)，所述干燥形式以不含水分为基础。

用带有微型容器的Eberbach搅拌器粉碎所述的冻干固体。所得粉末用无菌100μm尼龙膜筛进行筛分，以获得粒径小于100μm的粉末，依次用不同孔径的无菌尼龙膜(40、70和100μm；Cell strainer，BectonDickinson Labware)筛分，而获得各种粒径的粉末(小于40μm、40μm～70μm和70μm～100μm)。对于大于100μm的颗粒，也用200μm筛进一步筛分，得到100μm～200μm的颗粒。使用玻璃过滤器支架在真空条件进行筛分，将粉末收集到0.22μm膜上。该粉末于室温下保存。

对照粉末也用具有除离子聚合物之外的所有组分的制剂制备。

按照表2制备含有HMW芦荟果胶的两种粉末，一种是含有BSA的试样，而另一种是不含有BSA的对照试样，经粉碎并筛分，获得小于100μm的粉末。经过采用水分分析仪在120℃的干燥温度下进行测定，两种粉末试样的水分含量为2重量％～3重量％。

实施例16

粉末剂型的凝胶化特性

为了弄清粉末剂型的凝胶形成特性，所述粉末剂型的制备如实施例15所详述，将由各种果胶和藻酸盐制备的粉末(10mg，小于100μm)悬浮于2ml盐水溶液中。一个试样组的盐溶液包含3mM氯化钙，另一个试样组不含氯化钙。钙存在时，粉末颗粒与水化合但仍保持颗粒形式，悬浮液保持浑浊。在显微镜下，在钙盐水中的粉末颗粒变成清澈而透明的凝胶颗粒或块。相反，没有钙存在时，颗粒在约10分钟内很快溶解，悬浮液变成清澈的溶液(但由高分子量的芦荟果胶制备的粉末除外，其不易溶于一般的NaCl盐水中，但在盐水中也不形成凝胶，见下文的讨论)。

当将钙螯合剂EDTA(10mM)加入到上述的粉末悬浮的钙盐水中时，颗粒在约10分钟内很快溶解。

当将由果胶或藻酸盐制备的粉末悬浮于正常小牛血清中时，也得到类似的结果。即，在悬浮于含钙的正常小牛血清中后，粉末颗粒保持固体颗粒形式。但一旦加入EDTA，大部分颗粒在约10分钟内很快溶解。采用模拟鼻液(每100ml含有0.867g NaCl、0.44g Na₂HPO₄、0.108gNaH₂PO4、0.058g CaCl₂.2H₂O、0.31g KCl。参见Lorin等，Journal ofLaboratory Clinical Medicine，2，275～267，1994)进行实验时，也观察到类似的结果。这些实验表明，悬浮于含游离钙离子的溶液的粉末颗粒形成钙交联凝胶，但如果没有钙，或者如果用螯合剂从胶中去除钙时，则不形成凝胶或者凝胶不稳定，并且多糖颗粒溶解。

如上所指出的，HMW芦荟果胶可溶于水，但不易溶或者仅部分溶于NaCl盐水或缓冲的盐水中。含HMW芦荟果胶的粉末颗粒可通过离心(500g，5min)从NaCl盐水中回收，将其重悬于水中则可在数分钟内迅速溶解。与这种特点相反的是，由低分子量LM果胶、多聚半乳糖醛酸、LMW芦荟果胶或藻酸盐制成的颗粒易溶于水和NaCl盐水中。然而，当将从含钙的盐水或正常小牛血清溶液中分离的颗粒置于水中时，其仍保持颗粒形式，表明不同的多糖粉末颗粒在钙离子存在时均形成凝胶。

实施例17

用于凝胶形成的固体和液体制剂与对照的药物释放的比较

制备由不同的阴离子多糖和坚牢绿染料水溶液(1mg/ml)组成的液体制剂。坚牢绿用于模拟小分子治疗剂。阴离子多糖的浓度采用：对于HMW芦荟果胶，其浓度为0.5％、对于藻酸盐，其浓度为1％，以及对于多聚半乳糖醛酸、LMW芦荟果胶和LM柑橘果胶，其浓度为2％。为了制备固体制剂，将20μl的水性制剂作为滴剂置于称量盘中，冻干，然后回收成干燥的圆片。

在60mm培养皿中，将干燥制剂的圆片，或者20μl的液体制剂加到3.5ml的正常小牛血清中，该血清加入或者不加入10mM EDTA。经过一段之间，通过测定制剂的原始置入点周围的坚牢绿染料的扩散圆周的直径，观测模拟药物的释放的坚牢绿染料的扩散。

在没有EDTA的正常小牛血清中，干燥制剂圆片保持固体圆片的形状，并逐渐变成清澈的固体凝胶块。24小时后，当所有染料扩散掉后，干燥制剂的凝胶变得清澈透明。通过将凝胶圆片浸入含有10mM EDTA的盐水中，进一步证实干燥剂型的凝胶形成，其中凝胶在约30分钟内很快溶解。在含有EDTA的正常小牛血清中，干燥剂型圆片也逐渐溶解，成为圆片或膜。

相反，大多液体制剂逐渐溶解和/或扩散，没有形成与原始滴剂类似的独特的胶块，2小时后轻轻摇动培养皿，只能检测到所形成的溥层凝胶块。因此，粉末制剂的凝胶化显得要比液体制剂更为有效。然而，当通过25G针滴到50mM CaCl₂溶液中时，液体制剂均保持在一起，形成凝胶珠。然而，由HMW芦荟果胶制成的液体制剂保持在一起，形成凝胶小块，其大小仅稍稍大于血清中的原始滴剂。这进一步说明高分子量芦荟果胶形成凝胶的高效率。总之，这些观察结果表明，干燥制剂形成原位凝胶的效率优于液体制剂。

采用了干燥制剂和液体制剂，将该制剂浸入到含有或不含有EDTA的正常小牛血清中，经过一段时间后，测定坚牢绿在制剂周围扩散圆周的直径(见图6)。结果表明，在没有EDTA的固体制剂或液体制剂试样形成的凝胶减缓了染料或药物的释放，这与干燥制剂的凝胶形成更有效的观察结果一致。所有制剂中均观察到相同的结果，但对于用HMW芦荟果胶制成的干燥制剂来说，含EDTA的血清中的染料扩散只是稍快于不含EDTA的血清中的染料扩散。这可能与HMW芦荟果胶不太溶于或不溶于盐水中有关，是HMW芦荟果胶的又一个特征。

实施例18

采用含可溶性钙盐的粉末诱导多糖/活性剂粉末制剂的原位凝胶化

对包含蛋白活性物质(BSA)和选自LMW芦荟果胶或藻酸盐的多糖的粉末制剂(如表2中的试样2和5所述)进行筛分，制备粒径低于100μm的粉末。由含有2.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、10％(w/v)乳糖和1％(w/v)氯化钙的液体制剂制备含钙粉末，其中，干燥所述的液体制剂溶液，研磨该固体，并对粉末进行筛分，使粉末粒径小于40μm，干燥后制得氯化钙含量为7.4％的凝胶诱导性粉末。以4∶1的重量比混合多糖粉末和凝胶诱导性粉末，获得氯化钙最终含量为1.48重量％的粉末混合物。

将粉末混合物悬浮于盐水(在1ml中含有5mg)。当将所有三个未混合的粉末(即果胶+蛋白、藻酸盐+蛋白、以及含钙凝胶诱导性粉末)分别悬浮于NaCl盐水中时均发生溶解。然而，钙凝胶诱导性粉末与含有LMW芦荟果胶+蛋白或藻酸盐+蛋白的粉末的混合物不溶于NaCl盐水中。当采用溶菌酶作为活性剂时，也获得相同的结果。这些结果表明，当与体液的盐水溶液模型接触时，含钙粉末诱导多糖/蛋白粉末凝胶化。

实施例19

采用含有难溶性多价阳离子盐的粉末诱导多糖/活性剂粉末制剂的原位凝胶化

氢氧化铝(Al(OH)₃)难溶于水，但已经被批准作为人用的药物辅剂。购自Sigma Chemical Co.的一种氢氧化铝悬浮液是发白的、不清澈的，但却是均匀的颗粒悬浮液。芦荟果胶溶液(2mg/ml的水溶液)当与不溶性氢氧化铝凝胶悬液混合时成胶，形成肉眼可见的大的氢氧化铝的聚集体。采用其它的果胶和藻酸盐，也可观察到类似的结果。聚集体很大，而且当达到适当的聚合物/氢氧化铝的比例时很容易看见。采用磷酸钙(Sigma Chemical Co.)，也可观察到类似的结果，不过形成的聚集体不如氢氧化铝形成的聚集体大。氢氧化铝和磷酸钙均是相对不溶性物质(Merck Index，第13版)，但这些难溶性盐与水化合时容易在表面发生离子化，使其可与芦荟果胶反应。

为了进一步研究这一观测结果，将氢氧化铝和磷酸钙粉末悬浮于水或盐水(10mg/ml)中，然后与不同的终浓度(2.5～0.0012mg/ml)的HMW芦荟果胶溶液混合。观察到了大的聚集体的形成，这显示有相同的凝胶形成。采用藻酸盐、LM果胶和多聚半乳糖醛酸，也观察到相同的结果，表明可以使用难溶性二价或多价金属阳离子盐作为凝胶诱导剂。

作为例子，以3∶1的比例混合如实施例15的由芦荟果胶(HMW)制备的粉末制剂与氢氧化铝粉末。将该混合物(10mg)悬浮于2ml盐水中。立即形成了大的聚集体。向该悬浮液中加入甲苯胺蓝，以对离子聚合物粉末颗粒进行染色。30分钟或更长时间后，取一小滴悬浮液置于载玻片上，并在显微镜下观察。聚集体包含染成粉色的粉末制剂颗粒和半透明浅灰色的氢氧化铝颗粒，这一结果确证了聚集体的形成。

作为第二个例子，以3∶1的比例混合由LMW芦荟果胶制成的粉末制剂与氢氧化铝粉末，并将粉末混合物悬浮于盐水中。虽然有聚集体形成，但在显微镜下观察，只看到很少的染成粉红色的粉末形式，而聚集体似乎主要由氢氧化铝颗粒组成。这表明粉末颗粒制剂溶解，不溶性盐并未引起全部制剂颗粒凝胶化。

然而，当将多糖制剂/氢氧化铝粉末混合物悬浮于含有3mM氯化钙的盐水中，又观察到多糖制剂颗粒，也形成由制剂颗粒和氢氧化铝颗粒组成的聚集体。当将所述混合物悬浮于正常小牛血清中时，也观察到相同的聚集体形成。

难溶性金属离子盐可能不容易渗入含有制剂颗粒的多糖，因此不会引起全部颗粒的凝胶化，而可能只在颗粒表面上引起聚合物交联或凝胶化。由于它们难溶，或近乎不可溶，未溶解的含多价阳离子的颗粒可以作为凝胶的物理载体，或作为交联性二价或多价阳离子的长期来源。此外，粉末制剂颗粒和难溶的固体凝胶化诱导剂可引起凝胶化聚集体组合物的形成。根据混合物中的这两种不同粉末比例和相对粒径，可以改变和/或调节所形成的聚集体的大小和其它特性。在高或低比例下，聚集体颗粒的大小可非常小，一种类型的颗粒被另一种类型的颗粒所包围，而当比例约为1时，颗粒可以象网络那样互相连接，形成大的网络。因此，在不同条件下形成的聚集体凝胶复合物可用于调节在给药位点(例如在粘膜表面和/或鼻腔中)的原位凝胶的物理、溶解度和时间释放(timerelease)等特性。

实施例20

从粉末制剂中持续释放药学活性剂

可采用模拟鼻液(SNF)作为释放介质来评价原位凝胶化粉末制剂对活性物质的释放的效果。按上述方法制备粉末制剂，该制剂含有不同含量的聚烯吡酮和乳糖，但均具有相同蛋白(BSA)含量(0.1％，以干重计)(见表3)。对照粉末含有除离子聚合物(HMW芦荟果胶)之外的所有其它成分。

表3

组合物制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)^*
组合物制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)^*				1	1	2	2
HMWAP聚烯吡酮乳糖BSA	0.4(2.6)15(97.3)0(0)0.015(0.097)	对照0(0)15(99.93)0(0)0.015(0.099)	0.4(3.1)2.5(19.3)10(77.4)0.0125(0.097)	1	1	2	2	对照0(0)2.5(19.97)10(79.9)0.0125(0.099)

^*以不含水分为基础。

将10mg的粉末悬浮于0.25ml的SNF中。30分钟后，通过离心将溶液或上清液与颗粒或小球粒分开，采用SDS凝胶电泳和密度测定分析法分析上清液和小球粒中的蛋白。通过以下公式计算蛋白试剂从各制剂中释放的释放百分比：

[上清液中的蛋白/(上清液中的蛋白+小球粒中的蛋白)]×100％。

发现蛋白从对照粉末几乎全部释放(释放超过90％)，所述对照粉末完全溶解。相反，蛋白从含有芦荟果胶的粉末上释放的速度明显减缓：对于用离子聚合物制备的粉末，其释放率仅为55％(制剂1)或68％(制剂2)(图7)。采用溶菌酶作为活性剂，也获得类似的结果。还发现制剂2释放蛋白要快于制剂1。制剂2含有2.5％的PVP和10％的乳糖，而制剂1含有15％的PVP但不含乳糖(表3)。这表明可以通过所用赋形剂的种类和用量来进一步调节释放速度。

实施例21

药学活性剂、多糖、凝胶诱导性组合物和其它赋形剂的粉末的物理混合物

按照表2所示制备不含活性物质的粉末制剂，并经筛分获得适当的粒径。然后将该聚合物粉末与活性剂粉末(其制备中采用或不采用药学可接受的赋形剂)相混合。其中也可选择选性地包含在本文别处描述的一种或多种固体凝胶诱导性组合物。然后将粉末的混合物输送到动物中。

实施例22

采用鼻内给药对动物施用含有抗原的粉末疫苗制剂

含有高分子量的芦荟果胶和白喉毒素突变体CRM(DT-CRM)抗原的粉末疫苗制剂通过以下方法制备：将如表4所列成分溶于水性溶液中，将该溶液冻干，获得粉末，研磨该粉末，然后对其进行筛分。含除抗原之外的所有成分的对照制剂由类似方法制备。

表4

组分	抗原制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)	对照制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)
组分	抗原制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)	对照制剂液体(％，w/v)和干燥(％，w/w)	HMWAP	0.4(3.1)	0.4(3.1)
聚烯吡酮	2.5(19.4)	2.5(19.4)	HMWAP	0.4(3.1)	0.4(3.1)
聚烯吡酮	2.5(19.4)	2.5(19.4)	乳糖	10(77.5)	10(77.5)
DT-CRM	0.01(0.077)	0(0)	乳糖	10(77.5)	10(77.5)

制备疫苗制剂，使每10mg粉末制剂可以输送7.75μg的抗原。如前所述(Ryden和Edman，Iht.J.Pharm.83(1992)，第1～10页；Schipper等，Pharm.Res.10(1993)，第682-686页)，首先麻醉重量为200g～250g的大鼠，用连接于5ml的注射器上的200μl的移液枪头，使3ml空气通过胶管以向每个鼻孔输送10mg的粉末。

接种一周后，从大鼠中收集血清试样，用ELISA(酶联免疫吸附测定)分析特异性血清IgG(免疫球蛋白G)。IgG滴度的终点通过吸收值高于背景(未加血清的抗原-包覆孔的吸收值)50％的最高稀释倍数的倒数来确定。

施用DT粉末的两只大鼠只需一周即产生抗DT-CRM抗原的抗体，其平均IgG滴度为800。施用不含有DT-CRM抗原的对照制剂的对照大鼠不产生所述抗体(图8)。这一结果表明，经鼻施用粉末疫苗制剂可以有效地诱导大鼠产生特异性免疫应答。

实施例23

通过肠胃外给药对动物施用粉末制剂

如实施例16的描述，当悬浮于含钙盐水中时，粉末颗粒保持颗粒状或变成凝胶颗粒。因此，粉末在悬浮于钙盐水或钙缓冲的盐水中之后，可作为颗粒悬浮液进行注射。或者，在注射到动物的组织中之前，将粉末制剂预先与钙粉末混合，如实施例17的描述，其中粉末悬浮于盐水或缓冲的盐水中。采用实施例16所述的粒径小于100μm的粉末制剂，但是，对于注射悬浮颗粒的实施方式，更小的粉末粒径是希望的。

将各粉末(80mg)悬浮于含3mM CaCl₂的0.4ml盐水中，并经皮注射施用于小鼠(每一注射位点0.1ml，2个位点/小鼠)。在注射后4小时，杀死小鼠，剥开皮肤，检查注射位点。在用含有离子聚合物的粉末制剂注射的位点观察到代表水合的和凝胶化颗粒的小节结或肿胀区域。相反，采用不含有离子聚合物的对照粉末时没有观察到所述的小节结或肿胀区域。此外，注射位点包括对照的注射部位非常湿，这可能是因为存在高度吸水的聚合物聚乙烯吡咯烷酮。

实施例24

外源凝胶诱导剂及组合物对液体制剂的凝胶化的影响

0.6％(w/v)HMW芦荟果胶水溶液与不同浓度的氯化钙二水合物溶液以1∶1的比例(1ml对1ml)混合，以使聚合物的最终浓度为0.3％(w/v)，而二水氯化钙的最终浓度为0.0019％～0.5％(w/v)。见下表5。立即对混合物进行旋涡振荡，然后于室温保存该试管，经过一段时间后进行观察。在二水氯化钙的最终浓度高于0.03125％(w/v)(2.125mM)时，一经混合即明显出现全部或部分凝胶形成，因为溶液完全或部分凝固，并且当倾斜试管时不再自由流动。在0.0156％CaCl₂浓度下，溶液的粘度增加，出现颗粒状凝胶块。然而，在终浓度小于0.0078％(0.53mM)或更低时，没有凝胶的形成，而混合物仍是均一的，并且在超过24小时后仍然如此。

表5

浓度(％，w/v，终浓度)^*
浓度(％，w/v，终浓度)^*										0.5	0.25	0.125	0.0625	0.0313	0.0156	0.0078	0.0039	0.0019	0
CaCl₂.2H₂OZnCl₂	++	++	++	++	++	±±	--	--	--	0.5	0.25	0.125	0.0625	0.0313	0.0156	0.0078	0.0039	0.0019	0	--

^*“+”表示形成完整的凝胶，“±”表示形成部分的凝胶，而“-”表示没有形成凝胶并且溶液保持清澈和匀质。

为了证明二价阳离子的加入可以促进原位凝胶化，采用正常小牛血清按实施例3所述方法进行凝胶前沿迁移测试。于是，将1ml含0％、0.0039％或0.0078％氯化钙或氯化锌的3mg/ml的果胶溶液轻轻置于10×75mm玻璃检测试管中的3ml正常小牛血清上。自界面开始，凝胶逐渐在果胶溶液中形成。由于相对于溶液而言，凝胶的浊度稍有增加，因此在光源下可以容易地对凝胶进行鉴定。于是，经过一段时间，测定果胶溶液相中界面的凝胶长度(厚度)。结果表明，与没有加氯化钙的对照相比，在所测试的两种外源氯化钙浓度，凝胶形成增加(图9)。

应当指出的是，采用表5所示结果是有利的，其中，将少量二价阳离子例如钙或锌(即低于约0.0156％(w/v))加入果胶/药物溶液，不会引起明显的凝胶化，令人意想不到的结果是，当将溶液施用于含钙离子的组织或体液时，可以诱导出改善了的凝胶化。

实施例25

各种单价阳离子对LM果胶溶液特性的影响

在水中制备各种浓度的NaCl和NH₄Cl溶液。然后将所得溶液与LM果胶、HMW芦荟果胶或HM果胶溶液以1∶1(v/v)混合。如实施例15所述，过滤HM果胶(DM＝64％，Sigma chemical Co)，以去除不溶性物质。然后在室温对所述溶液进行1小时的观察。然后将该溶液于4℃冷却2小时或更长时间，并再次进行检测。

在室温下，甲基化程度低于50％的果胶呈现出盐浓度依赖性的果胶沉淀(见表6和7)。HMW芦荟果胶最容易形成沉淀，其次是LM果胶。采用HMW芦荟果胶，也可观察到果胶浓度依赖性效应，即果胶浓度越低越不容易形成沉淀。例如，在0.15M NaCl中的0.5％HMW芦荟果胶溶液中，沉淀慢慢地形成，而在0.1％果胶溶液中则不形成沉淀。此外，分子量也有影响，采用0.15M NaCl中的0.5％LMW芦荟果胶则没有观察到沉淀。HM果胶溶液在任何所测试的浓度或温度下均不形成沉淀或凝胶。

表6

NaCl(M)
NaCl(M)								0	0.1	0.15	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
HMW AP 0.1％(MW＝15×10⁵)0.5％LM果胶(0.5％)HM果胶(0.5％)	-(-)-(-)-(-)-(-)	-(-)-(G/P)-(-)-(-)	-(G)P(G/P)-(-)-(-)	-(G)P(P)-(-)-(-)	P(P)P(P)-(-)-(-)	P(P)P(P)P(P)-(-)	P(P)P(P)P(P)-(-)	0	0.1	0.15	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	P(P)P(P)P(P)-(-)

″-″，没有变化；″P″，形成沉淀；″G″，清澈的凝胶；″G/P″，不清澈的凝胶；括号中的字母或标记表示在4℃保持2小时后的观察结果。

于4℃冷却可以促进沉淀的形成。然而，在0.15M和0.2M NaCl溶液中，0.1％HMW芦荟果胶可以形成清澈的凝胶。这种凝胶是可逆的，当放回室温后又变回溶液。这种可逆凝胶可在4℃和室温之间变换重复进行数次。一旦在室温下变回溶液，如实施例25所述，该制剂仍可以与正常小牛血清原位凝胶化。

这些结果表明，沉淀或凝胶形成与低DM和HMW有关，即DM越低而分子量越高，果胶越容易被盐所沉淀。

经观察，NaCl和NH₄Cl之间存在明显的区别。形成沉淀所需的NH₄Cl浓度要比NaCl高得多。还观察到类似的果胶浓度依赖性效应。见表7。对于0.5％HMW芦荟果胶，在室温下0.6M以及在4℃0.4M均形成沉淀。

沉淀是发白的，并且可以是细或粗的颗粒状，这取决于盐的浓度。在分界点或在沉淀开始出现的盐浓度下，沉淀最细。这实际上是一种有效的制备用于药物输送的细颗粒果胶的方法。

表7

NH₄Cl(M)
NH₄Cl(M)								0	0.1	0.15	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
HMW AP 0.1％0.5％LM果胶(0.5％)HM果胶(0.5％)	-(-)-(-)-(-)-(-)	-(-)-(-)-(-)-(-)	-(-)-(-)-(-)-(-)	-(-)-(-)-(-)-(-)	-(-)-(G/P)-(-)-(-)	-(-)P(P)-(-)-(-)	-(P)P(P)-(-)-(-)	0	0.1	0.15	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	P(P)P(P)-(-)-(-)

除了揭示不同果胶的基本特性之外，这些观察结果还表明，对于在生理离子强度或作为等压溶液下(如包括0.9％(w/v)-0.154M NaCl)采用HMW芦荟果胶制备液体制剂，如果需要将所述制剂作为溶液于4℃保存并且其中果胶浓度大于1mg/ml，就需要采用可代替NaCl的盐，如对于需要在冰箱中保存的不稳定活性物质如蛋白质的生理离子强度液体原位凝胶化制剂，这是可以想象的。这种溶液在冷藏时一些或所有果胶的沉淀是非常不合乎要求的。NH₄Cl是可以在所述制剂中施用的所述的可代替的盐，尤其是在其用于等压溶液(0.84％(w/v)或0.157M，其离子强度相当于0.154M)。在该浓度下，NH₄Cl也可以改善所述基于果胶的液体药物组合物的原位凝胶化。

实施例26芦荟果胶在鼻腔中的原位凝胶化

在10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液中制备0.5％的芦荟果胶溶液，该缓冲溶液含有0.84％的NH₄Cl，pH7.4，含有或不含蛋白(BSA)。该液体制剂通过直接滴到小鼠的鼻孔上而进行鼻内给药，然后通过吸入甲氧氟烷来麻醉小鼠，20μl/小鼠，均分于两个鼻孔。在接种4小时后，杀死小鼠，并将其组织固定在福尔马林中。采用自前鼻腔开始到眼眶的鼻腔制作一系列的横切片。

通过用甲苯胺蓝和H&E染色组织切片来检测凝胶。甲苯胺蓝将原位凝胶染成带粉色/略带紫色的物质，而H&E则将凝胶染成浅粉色(图10)。凝胶具有各种形状和大小，并且在包括那些接近隔膜和外耳的中部和低部区域的各种鼻腔区域可以见到凝胶。

为确定芦荟果胶浓度的影响，将0.25％或0.5％的芦荟果胶溶液鼻内施用于小鼠，每种浓度两只小鼠。给药后4小时，对凝胶的形成进行显微测定。用Image J software(National Institute of Health)测量各切片的凝胶面积，所述面积以mm²表示。将相同位置的横切片的凝胶面积作为鼻腔中的凝胶相对量的间接度量。因此，所述结果表明，采用0.5％所检测到的凝胶比0.25％更多更大，这表明在鼻腔中形成的凝胶量受到聚合物浓度的影响。

实施例27

比较其它果胶在鼻腔中的原位凝胶化

一起使用各种商购LM果胶和HMW芦荟果胶(表8)。这些商购果胶，即从Sigma Chemical Co.所购买的Genu果胶和多聚半乳糖醛酸，以其所购买时的形式使用。还使用了Genu果胶LM12G再加工的一个试样。将Genu果胶LM12G溶解水中，微过滤，乙醇沉淀，真空干燥后称为Genu果胶LM12G(R)。Genu果胶splendid型100的分子量类似于其它低分子量的果胶(表8)。所使用的两种不同的HMW芦荟果胶试样称为A和B。

在水中将所有的商购果胶样品制成2％(w/v)溶液，然后用2×盐水(0.3M NaCI)以1∶1的比例稀释。这些商购果胶溶解时产生低pH，即3～4。用NaOH将所述溶液的pH调整到6.5。上述制备的HMW芦荟果胶在0.84％(w/v)NH₄Cl中的终浓度为0.5％(w/v)。HMW芦荟果胶溶液的pH为5.5～6.0，并且无需调整pH值。如上所述，所有试样采用鼻内给药而施用于小鼠，每试样两只小鼠。4小时后用如上所述的方法检测凝胶的形成。

表8

果胶	DM	MW(DA×10⁵)	浓度(％，w/v)	凝胶面积(mm²)
果胶	DM	MW(DA×10⁵)	浓度(％，w/v)	凝胶面积(mm²)	Genu果胶LM12G	31％	NA	1	0.0075
Genu果胶LM12G(R)	31％	＞2.0	1	0.0015	Genu果胶LM12G	31％	NA	1	0.0075
Genu果胶LM12G(R)	31％	＞2.0	1	0.0015	Genu果胶LM18G	40％	NA	1	未观察
Genu果胶splendid型100	15％	3.8	1	未观察	Genu果胶LM18G	40％	NA	1	未观察
Genu果胶splendid型100	15％	3.8	1	未观察	多聚半乳糖醛酸，Sigma Chemicalco	＜3％	1.7	1	0.0023
HMW AP(A)	＜10％	＞10	0.5	0.049	多聚半乳糖醛酸，Sigma Chemicalco	＜3％	1.7	1	0.0023
HMW AP(A)	＜10％	＞10	0.5	0.049	HMW AP(B)	＜10％	＞10	0.275	0.051

采用小鼠从前鼻开始到眼眶的鼻腔制作横切片，每只小鼠2个横切片。以相同位置的切片的凝胶面积作为鼻腔中存在的凝胶的相对量的间接度量。测定每组两只鼠4个横切片的总凝胶面积，并除以4以获得每个鼻子的横切片的平均凝胶面积。结果表明，用Genu果胶LM12G、Genu果胶LM12G(R)、多聚半乳糖醛酸、HMW芦荟果胶，均检测到了凝胶，而对于采用LM18G和Slendid Type 100果胶的制剂，则没有观察到凝胶，后两种果胶具有低甲基化程度和通常的分子量。对于Genu果胶LM12G、多聚半乳糖醛酸，所检测到的凝胶面积非常有限，或者比由HMW芦荟果胶制得的制剂小6.5倍～33倍，而HMW芦荟果胶的使用浓度至少低2倍(见表8)。这些结果同样表明，相对于现有技术的果胶，HMW芦荟果胶的凝胶化特性意想不到的优异。

实施例28

原位凝胶在鼻中的滞留时间

为了确定原位凝胶在鼻中的滞留时间，通过鼻内给药施用0.84％(w/v)NH₄Cl中的HMW芦荟果胶溶液(5mg/ml)，并且在不同时间点检测凝胶形成，每个时间点两只小鼠。所存在的凝胶的相对量通过测量上述鼻腔组织切片上的凝胶面积来确定。

结果显示，凝胶在24小时内一直滞留于鼻腔中，但在48小时内消失(表9)。根据所测定的鼻腔组织横切片上的凝胶面积，在24小时时有50％清除率。因此，凝胶在鼻腔中的滞留时间在24小时和48小时之间。

表9

小时
小时					1	4	8	24	48
是否存在凝胶	是	是	是	是^*	1	4	8	24	48	否

^*鼻内给药后24小时，通过测定鼻腔的横切片的凝胶区域，鼻腔内凝胶量减少大于50％。

实施例29

通过鼻内给药将液体制剂施用于动物后增强了对DT-CRM和流感抗原的免疫应答

抗原、动物和接种：采用了两种抗原，即DT-CRM (白喉毒素突变体CRM)和灭活亚病毒体裂解流感病毒抗原(A/New Caledonia/20/99，H1N1)。对每组6～8周龄的7只Balb/c雌性小鼠进行鼻内接种2或3次，采用由抗原(0.5mg/ml)、HMW芦荟果胶(用于DT-CRM的浓度为5mg/ml而用于流感的浓度为2.75mg/ml)或两者的组合组成的制剂，间隔10天将其直接滴到小鼠的鼻孔中进行接种(20μl/小鼠)。抗原剂量为10μg/小鼠。抗原制剂制备于0.84％NH₄Cl和10mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.4。

试样收集和ELISA：在最后一次接种后两星期，收集血液和肺部液体试样。通过间接ELISA(酶联免疫吸附测定)测定特异性血清IgG(免疫球蛋白G)和肺IgA(免疫球蛋白A)。对于流感(Flu)，获自Protein ScienceCo.的A/New Caledonia/20/99(H1N1)的重组HA(血红素凝结素)蛋白也被用作抗原，以检测HA-特异性应答。IgG滴度的终点通过吸收值高于背景(未加血清的抗原-包覆孔的吸收值)50％的最高稀释倍数的倒数来确定。通过两个分开的ELISA程序，分析每种肺部液体的抗原特异性IgA和总量IgA。结果用ng(特异性)/μg(总量)表示。为了确定抗原特异性IgA的水平，用抗原还有系列稀释的纯化小鼠IgA基准物(1.0～0.002μg/ml)包埋平板。抗原特异性IgA的水平通过用纯化小鼠IgA基准物制成的标准曲线来计算。总量IgA采用小鼠IgA作为基准物通过夹心ELISA进行测定。

确定每一组小鼠的平均血清IgG滴度和肺部液体中特异性IgA与总量IgA比率以及它们的标准误差。平均值用斯氏t检验进行比较。滴度大于10的血清试样或特异性IgA/总量IgA比率比对照高2倍的肺部液体试样被认为有应答产生。

结果：只有当用芦荟果胶输送抗原才获得强的血清IgG和肺IgA应答。而单独施用抗原则只检测到微弱应答或没有检测到应答。

DT-CRM：不管一次接种后还是多次接种后，施用抗原与芦荟果胶的组合获得的血清IgG和肺IgA应答显著高于单独施用抗原。用芦荟果胶/DT-CRM一次接种后3周检测到应答高峰。采用芦荟果胶/DT-CRM接种，初始免疫应答也相对较快，在第2周即可检测到。

接种3次后，施用芦荟果胶/DT-CRM组的小鼠所具有的血清IgG和肺IgA滴度显著高于单独施用DT-CRM的组(分别为50或100倍)(图11a和11b)。此外，施用芦荟果胶/DT-CRM组的所有7只小鼠均存在血清IgG和肺IgA应答，而单独施用DT-CRM组中，7只小鼠中有4只小鼠存在血清IgG应答，而7只小鼠中有3只小鼠存在肺IgA反应。单独施用芦荟果胶组则没有检测到应答。

流感：接种两次后，施用芦荟果胶/Flu抗原的小鼠所具有的血清IgG(6倍)和肺IgA(60倍)滴度显著高于单独施用Flu抗原的组(图11c和11d)。对于血清IgG，施用芦荟果胶/Flu抗原和施用单独的Flu抗原的所有7只小鼠均有应答。然而，对于肺IgA，施用芦荟果胶/Flu抗原的7只小鼠中的6只小鼠产生应答，而施用单独Flu抗原组中只有1/7小鼠产生应答。而单独施用芦荟果胶的组中没有检测到应答。

当用重组HA蛋白作为抗原用于HA特异性IgG或IgA的ELISA测定中时，也观察到同样的结果。

实施例30

含乳糖和芦荟果胶的经鼻粉末流感疫苗组合物的原位凝胶化

通过混合乳糖(Sigma Chemical Co or NF grade，Fisher Scientific)、获自DelSite Biotechnologies Inc of Irving Texas的一种极低甲氧基且高分子量的芦荟果胶和流感抗原溶液，制备经鼻粉末流感疫苗制剂。所述抗原为裂解亚病毒体抗原；来自A/New Caledonia/20/99株，N1N1。将乳糖、芦荟果胶(AP)溶于水，而抗原则用水中或缓冲的盐水(10mM磷酸盐，pH 7.2；150mM NaCl或NH₄Cl)进行配制，其浓度如表1所示。然后，按所示体积进行混合。然后冻干液体混合物。对于冻干，将液体混合物在-80℃下冷冻1小时，然后在真空度(vacuum till)小于100微米汞柱(Centrivap，Labconco)下干燥。

通过冻干制得多孔固体，在微粉搅拌器(microblender)碾碎所述固体，将所得粉末在真空下用无菌40μm和100μm尼龙膜(cell strainers，BD)进行筛分，得到粒径为40μm～100μm的粉末。40μm～100μm的颗粒的收率可以不同，这取决于搅拌器的速度和搅拌时间，但可以超过干燥制剂总量的50％。不含抗原的对照制剂也按类似的方法制备而不包括抗原。

表9

溶液成分	体积(ml)	％w/v(液体混合物)	％w/w(计算，干燥后)
溶液成分	体积(ml)	％w/v(液体混合物)	％w/w(计算，干燥后)	芦荟果胶(1g/100ml)	1	0.1	1
乳糖(20g/100ml)	5	10	98.7	芦荟果胶(1g/100ml)	1	0.1	1
乳糖(20g/100ml)	5	10	98.7	流感抗原(0.29g/100ml)	1	0.029	0.289
水和缓冲的盐水	3	-	-	流感抗原(0.29g/100ml)	1	0.029	0.289

如表9所示，经计算，粉末含有约98.7重量％的乳糖、1重量％的芦荟果胶和0.289重量％的流感抗原，并将其制成每10mg粉末制剂可输送28μg抗原的制剂。还制备了不含抗原的对照制剂。

用含有抗原的制剂鼻内接种3只200g的一组Sprague-Dawley大鼠，用对照制剂鼻内接种另外3只大鼠的一组。如前所述(见Ryden和Edman，Int.J.Pharm.83(1992)，第1～10页；Schipper等，Pharm.Res.10(1993)，第682～686页)，首先将所述大鼠麻醉，用连接于5ml注射器上的200μl的移液枪头，使3ml空气通过胶管以将10mg粉末输送到每只大鼠的鼻孔中。10天后，用相同的方法再次处理所述大鼠。

在第二次接种后2、4和6周收集血液试样。在实验结束时(6周)采集肺部冲洗液试样。肺部冲洗液是在对动物实施安乐死后通过将3ml磷酸盐缓冲盐水插入到气管中进行的。用间接ELISA测定特异性血清IgG(免疫球蛋白G)和肺IgA。用流感抗原包埋96孔板，结合抗原的特异性血清IgG用抗鼠IgG-碱性磷酸酶偶联物进行检测。IgG滴度的终点通过吸收值(410nm)高于背景(未加血清的抗原包埋孔的吸收值)50％的最高稀释倍数的倒数来确定。

用两种分开的ELISA程序测定抗原特异性IgA和总量IgA。结果以ng(特异)/μg(总量IgA)表示。为了确定抗原特异性IgA的水平，用抗原以及一系列稀释的纯化大鼠IgA基准物(1.0μg/ml～0.002μg/ml)包埋培养板。抗原特异性IgA的水平通过用纯化IgA基准物的吸收值制成的标准曲线来计算。以纯化大鼠IgA作为基准物，采用夹心ELISA测定总量IgA。

通过利用小鸡红细胞(RBG)所进行的红血球凝集抑制性测定(HAI)来确定特异性血清抗体。HAI滴度的终点是产生RBC凝集的阳性抑制的最高血清稀释倍数。对每组大鼠的血清中平均IgG和HAI滴度以及肺部冲洗液中特异性IgA与总量IgA的比率进行测定。

在对照组中没有检测到抗体应答。采用ELISA和HAI测定，施用了流感抗原粉末制剂的所有3只大鼠均产生强烈的血清抗体应答(参见表2)。在人中，一般认为，滴度为大于或等于40的红血球凝集抑制(HAI)为预防性阈值。由处理大鼠所观测到的HAI滴度均高于1∶40，且与由ELISA得到的IgG滴度相称。此外，实验结束时(即6周)，还检测到显著水平的特异性肺IgA。

表10 平均抗体滴度

时间(周数)	血清IgG(ELISA)	血清HAI	肺IgA(ng/μg)
时间(周数)	血清IgG(ELISA)	血清HAI	肺IgA(ng/μg)	2	15360	87	--
4	17066	173	--	2	15360	87	--
4	17066	173	--	6	20480	187	10

实施例31

含有乳糖、芦荟果胶和聚乙烯吡咯烷酮的经鼻粉末流感疫苗组合物的原位凝胶化

根据表11的单子，通过混合乳糖(Sigma Chemical Co.或NF级，FisherScientific)、芦荟果胶、聚乙烯吡咯烷酮(Povidone K29-32，USP；SigmaChemical Co.)以及流感抗原溶液(裂解亚病毒体，A/New Caledoniall/99，H1N1)，制备经鼻粉末流感疫苗制剂。将乳糖、芦荟果胶和聚烯吡酮溶于水中，而抗原则用水或缓冲的盐水(10mM磷酸盐，pH 7.2；150mM NaCl或NH₄Cl)配制。然后，如上所述，冻干液体混合物，并制成粉末。以类似方法制备不含抗原的对照制剂而不包括所述抗原。

经计算，粉末包含约98.8重量％的乳糖、0.5重量％的芦荟果胶和0.2重量％的抗原，对该粉末进行配制，使每10mg粉末制剂可以输送20μg抗原。此外还配制了不含抗原的对照制剂。

表11

成分	体积(ml)	％w/v	％w/w(干燥后)
成分	体积(ml)	％w/v	％w/w(干燥后)	芦荟果胶(1g/100ml)	0.5	0.05	0.5
乳糖(20g/100ml)	5	10	98.8	芦荟果胶(1g/100ml)	0.5	0.05	0.5
乳糖(20g/100ml)	5	10	98.8	聚烯吡酮(30g/100ml)	0.017	0.05	0.5
流感抗原(0.2g/100ml)	2	0.02	0.2	聚烯吡酮(30g/100ml)	0.017	0.05	0.5
流感抗原(0.2g/100ml)	2	0.02	0.2	水和缓冲的盐水	2.483	-	-

采用与上面相同的方法进行动物实验和抗体测定，但不测量肺部冲洗液试样。在对照组中，没有检测到抗体应答。根据ELSIA和HAI所显示，在接受流感抗原粉末制剂的所有3只大鼠中，均观察到强烈的血清抗体应答。

表12 平均抗体滴度

时间(周)	血清IgG(ELISA)	血清HAI
时间(周)	血清IgG(ELISA)	血清HAI	2	5133	163
4	20507	113	2	5133	163
4	20507	113	6	13867	113

实施例32

由pH控制粉末制剂的凝胶化或沉淀形成

有许多聚合物，凝胶化或形成沉淀受到pH的影响。例如，壳聚糖谷氨酸盐在最高为6.5的pH下是可溶的，但超过pH 6.5时，它就变为不可溶，形成可用于控制药物释放的沉淀或凝胶样物质。因而，在等于或低于pH 6.5制备含壳聚糖的液体药物制剂，采用上述方法制成干燥粉末。输送后，尽管它们可被pH为7.0～7.4的体液或分泌液所水合化，但是这些颗粒由于内部缓冲能力而可以部分或全部地溶解。然而，对于鼻内给药的情况中，鼻液是酸性的，具有低至5.5的pH(England等，ClinicalOtolaryggology 24，67～68，1999；Ireson等，Clinical Science 100，327～333，2001)。

因而，将粉末制剂与适量的诸如pH 7.4的磷酸盐缓冲剂等缓冲剂粉末相混合。一旦进行输送和发生水合作用时，缓冲剂在水合后即快速溶解，保证局部环境的pH值为7.4，从而保持颗粒制剂的不溶性或在更长时间内的不溶性。

本申请全文参考了很多公开出版物和专利。为所有目的，尤其是其中关于药物组合物配制的教导，在此通过参考方式将这些出版物和专利所公开的内容作为整体引入到本申请中。

尽管本文公开了优选的组合物或制剂以及方法，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，根据上述教导，可以进行很多修正和更改。本领域的技术人员还应当认识到，这类修正和更改并不超出本发明附带的权利要求所描述的精神和范围。

Claims

1.用于将生理活性剂输送到动物中的固体药物组合物，该组合物包含：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；

2.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖选自果胶质、藻酸盐、角叉胶和结冷胶。

3.如权利要求1所述的固体药物组合物，该组合物的形式为小压块、片剂或胶囊。

4.如权利要求1所述的固体药物组合物，该组合物为粉末形式。

5.如权利要求4所述的固体药物组合物，其中所述粉末含有多数的微粒和/或微球体，所述微粒或微球体的粒径使其适于通过网孔直径为250μm的网筛。

6.如权利要求4所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖包含一种或多种果胶。

7.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是甲基化程度低于70％的果胶。

8.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是甲基化程度低于50％的果胶。

9.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是甲基化程度低于25％的果胶。

10.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是甲基化程度低于10％的果胶。

11.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是平均分子量高于约4.0×10⁵道尔顿的果胶。

12.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是平均分子量高于约1.0×10⁶道尔顿的果胶。

13.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种多糖是平均分子量高于约1.0×10⁶道尔顿并且甲基化程度低于约10％的果胶。

14.如权利要求6所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种果胶是芦荟果胶。

15.如权利要求6所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种果胶所具有的半乳糖醛酸的含量高于约80重量％。

16.如权利要求6所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种果胶所具有的鼠李糖的含量以摩尔计高于4％。

17.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述组织或体液是正常的小牛血清。

18.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种生理活性剂选自治疗剂、诊断剂、碳水化合物、脂、肽、核酸、活细胞、完整的死细胞或其部分、完整的微生物或其部分、完整的病毒或其部分、疫苗、抗原和蛋白。

19.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含肽或蛋白。

20.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含一种或多种抗原。

21.如权利要求20所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种抗原独立地选自肽、蛋白、完整的活细胞或其部分、完整的死细胞或其部分、完整的病毒或其部分、灭活的细菌或病毒、活的减毒细菌或病毒、噬菌体、亚单元疫苗蛋白、亚单元疫苗肽、亚单元疫苗碳水化合物、复制子、病毒载体、质粒。

22.如权利要求20所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种抗原独立地选自流感病毒抗原。

23.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述二价或多价金属阳离子是钙、镁、铜、锰、镍、钴、铁、锌或铝。

24.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述二价或多价金属阳离子是钙或铝。

25.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述药学可接受的盐在水中的溶解程度为至少约1×10^-5摩尔/升。

26.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述药学可接受的盐不溶于水，不能形成含有至少约1×10^-5摩尔/升的溶液。

27.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述药学可接受的盐包含氢氧化铝或磷酸钙。

28.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述多糖凝胶诱导性组合物进一步含有一种或多种药学可接受的赋形剂。

29.如权利要求28所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种药学可接受的赋形剂选自单糖或二糖、粘合剂、填充剂或膨胀剂、滑润剂、调味剂、味道掩饰剂。

30.如权利要求1所述的固体药物组合物，该固体药物组合物进一步包含一种或多种药学可接受的增稠剂。

31.如权利要求29所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种药学可接受的增稠剂选自聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶原质、白明胶、葡聚糖、透明质酸。

32.如权利要求29所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种药学可接受的增稠剂包含聚乙烯吡咯烷酮。

33.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种生理活性剂和一种或多种多糖以分子水平上的固体混合物存在，并且所述一种或多种固体的凝胶诱导性组合物是单独的固相。

34.如权利要求33所述的固体药物组合物，其中所述分子水平上的混合物通过以下方法制备：将所述一种或多种生理活性剂和一种或多种多糖溶解在液体载体中，然后去除液体载体而制得分子水平上的固体混合物。

35.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种生理活性剂、所述一种或多种多糖和所述一种或多种固体的凝胶诱导性组合物以分开的固体组分的物理性混合物存在。

36.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述动物是人。

37.如权利要求1所述的固体药物组合物，该固体药物组合物进一步包含约30.0％～约99.5％的一种或多种药学可接受的单糖或二糖。

38.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述单糖或二糖选自核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、海藻糖、或及混合物。

39.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述单糖或二糖是乳糖。

40.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求1所述的固体药物组合物施用于动物的组织或体液，以与动物的组织或体液接触而形成凝胶。

41.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求1所述的固体药物组合物或其组分的悬浮液施用到动物的组织或体液中，以与动物的组织或体液接触而形成凝胶。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述动物的组织或体液选自粘膜表面、血液、血清、泪液、肺部液体、肠液、或鼻分泌液。

43.如权利要求40所述的方法，其中所述动物是人。

44.如权利要求40所述的方法，其中所述动物的组织或体液是鼻粘膜表面或鼻分泌液。

45.由权利要求40所述的方法形成的凝胶。

46.将生理活性剂施用于动物的方法，该方法包括以任何顺序或组合将以下组分施用于动物的组织或体液以在与动物的组织或体液接触时形成凝胶：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；

47.如权利要求46所述的方法，其中组分a、b和c以粉末组合物的组分进行施用。

48.如权利要求46所述的方法，其中组分a和b以分开或混合的粉末施用。

49.如权利要求46所述的方法，其中组分a和b以一种或多种含有组分a的粉末和一种或多种含有组分b的粉末的混合物施用。

50.如权利要求46所述的方法，其中组分a和b以固体组合物的组分施用，其中所述固体组合物通过以下方法制备：将一种或多种生理活性剂和一种或多种离子多糖溶解在液体载体中，然后去除足量的液体载体而制得固体混合物。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述固体混合物为粉末形式。

52.如权利要求46所述的方法，其中所述组分a和b以存在于液体载体中的溶液施用。

53.如权利要求46所述的方法，其中所述一种或多种多糖包含低甲氧基的果胶。

54.如权利要求46所述的方法，其中所述一种或多种生理活性剂包含肽、蛋白或疫苗。

55.如权利要求46所述的方法，其中所述组织或体液是鼻粘膜表面或鼻分泌液。

56.如权利要求46所述的方法，其中所述动物是人。

57.用于将生理活性剂控制释放到动物中的组合物，该组合物包含：

a.有效诱导动物生理反应的量的一种或多种生理活性剂；和

b.具有甲基化程度低于约30％且平均分子量高于约1×10⁵道尔顿的一种或多种果胶质，

其中所述组合物为固体，当与动物的组织或体液接触时能够形成凝胶。

58.如权利要求57所述的组合物，其中所述组合物的形式为小压块、片剂、胶囊或粉末。

59.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质的甲基化程度低于约15％。

60.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质的平均分子量高于约5.0×10⁵道尔顿。

61.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质的分子量高于1.0×10⁶道尔顿且甲基化程度低于10％。

62.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质所具有的半乳糖醛酸的含量高于约90重量％。

63.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质包含3-甲氧基-鼠李糖。

64.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质所具有的鼠李糖的含量以摩尔计高于4％。

65.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质是芦荟果胶。

66.如权利要求57所述的组合物，其中所述组合物含有约等于或小于20％重量的水。

67.如权利要求57所述的组合物，该组合物含有微粒和/或微球体，所述微粒和/或微球体的粒径使其适于通过网孔直径为约250μm的网筛。

68.如权利要求57所述的组合物，其中所述组合物为粉末形式。

69.如权利要求68所述的组合物，其中所述粉末含有至少约80重量％的微粒和/或微球体，所述微粒和/或微球体的粒径使其适于通过网孔直径为100μm的网筛但不能通过网孔直径为约0.1μm的网筛。

70.如权利要求68所述的组合物，其中所述组合物基本上由微粒和/或微球体组成，其中所述微粒和/或微球体的粒径使其适于通过网孔直径为约50μm的网筛但不能通过网孔直径为约10μm的网筛。

71.如权利要求57所述的组合物，其中所述固体组合物包含微球体，其中低于90％的微球体的直径为0.1μm～10μm。

72.如权利要求57所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种药学可接受的增稠剂。

73.如权利要求72所述的组合物，其中所述一种或多种增稠剂选自聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶原质、白明胶、葡聚糖、透明质酸或藻酸盐。

74.如权利要求72所述的组合物，其中所述一种或多种药学可接受的增稠剂包含聚乙烯吡咯烷酮。

75.如权利要求72所述的组合物，其中所述增稠剂占该组合物重量的约01.重量％～约90重量％。

76.如权利要求57所述的组合物，该组合物进一步包含约30.0％～约99.5％的一种或多种药学可接受的单糖或二糖。

77.如权利要求76所述的组合物，其中所述单糖或二糖选自核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、海藻糖、及其混合物。

78.如权利要求76所述的组合物，其中所述单糖或二糖是乳糖。

79.如权利要求57所述的组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含选自治疗剂、诊断剂、碳水化合物、脂、肽、核酸、活细胞、完整的死细胞或其部分、完整的微生物或其部分、完整的病毒或其部分、疫苗、抗原和蛋白的一种或多种药学活性物质。

80.如权利要求57所述的组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含有效治疗动物疾病或疾病状态的量的治疗剂。

81.如权利要求57所述的组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含肽或蛋白。

82.如权利要求57所述的组合物，其中所述一种或多种生理活性剂包含一种或多种抗原。

83.如权利要求82所述的组合物，其中所述一种或多种抗原独立地选自肽、蛋白、完整的活细胞或其部分、完整的死细胞或其部分、完整的病毒或其部分、灭活的细菌或病毒、活的减毒细菌或病毒、噬菌体、亚单元疫苗蛋白、亚单元疫苗肽、亚单元疫苗碳水化合物、复制子、病毒载体、质粒。

84.如权利要求82所述的组合物，其中所述一种或多种抗原独立地选自流感病毒抗原。

85.如权利要求82所述的组合物，其中，当将所述组合物施用于动物鼻粘膜时，所述一种或多种抗原诱导动物产生主动免疫应答。

86.如权利要求82所述的组合物，其中，在将所述组合物施用于动物后，测定动物肺部冲洗液中的IgA水平，与施用不含所述果胶的对照组合物的对照实验所获得的IgA水平相比，动物免疫应答增加约10％。

87.如权利要求57所述的组合物，其中以该组合物的重量计，所述生理活性剂占该组合物的约0.01％～约90％。

88.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质占所述组合物重量的约0.0001％～约99％。

89.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质占该组合物重量的约0.001％～约50％。

90.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质占该组合物重量的约0.005％～约20％。

91.如权利要求57所述的组合物，其中所述果胶质占该组合物重量的约0.01％～约10％。

92.如权利要求57所述的组合物，该组合物进一步包含固体的多糖凝胶诱导剂。

93.如权利要求92所述的组合物，其中所述固体的多糖凝胶诱导剂包含一种或多种二价或多价金属阳离子的药学可接受的盐。

94.如权利要求93所述的组合物，其中所述二价或多价金属阳离子是钙、镁、铜、锰、镍、钴、铁、锌或铝。

95.如权利要求93所述的组合物，其中所述药学可接受的盐可溶于水，形成含有至少约1×10^-5摩尔/升的盐的溶液。

96.如权利要求93所述的组合物，其中所述药学可接受的盐是钙盐。

97.如权利要求93所述的组合物，其中所述药学可接受的盐是卤化钙盐。

98.如权利要求93所述的组合物，其中所述药学可接受的盐充分不溶于水，因而不能溶于水，不能形成含有至少1×10^-5摩尔/升的盐的溶液。

99.如权利要求93所述的组合物，其中所述一种或多种药学可接受的盐包含氢氧化铝或磷酸钙。

100.如权利要求93所述的组合物，其中所述一种或多种药学可接受的盐占该组合物的约0.1重量％～约80重量％。

101.如权利要求93所述的组合物，其中所述一种或多种二价或多价金属阳离子与果胶质反应而使果胶质的羧酸酯基团交联，从而形成含有金属阳离子的凝胶。

102.如权利要求93所述的组合物，其中在该组合物与动物的组织或体液接触时，所述一种或多种二价或多价金属阳离子的盐诱导该组合物形成凝胶。

103.如权利要求57所述的组合物，其中所述动物的组织或体液选自粘膜表面、血液、血清、泪液、肺部液体、肠液或鼻分泌液。

104.如权利要求57所述的组合物，其中所述动物的组织或体液是鼻分泌液。

105.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求57所述的组合物与动物的组织或体液接触。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述组合物在施用于组织或体液时或之后与组织或体液接触，形成含有生理活性剂的凝胶。

107.如权利要求105所述的方法，其中所述凝胶使生理活性剂持续释放到组织或体液中。

108.如权利要求105所述的方法，其中所述动物的组织或体液是鼻粘膜表面，并且所述一种或多种生理活性剂是流感抗原。

109.由权利要求105所述的方法所形成的凝胶。

110.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求57所述的固体药物组合物或其组分的悬浮液施用到动物的组织或体液中，以与动物的组织或体液接触而形成凝胶。

111.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求57所述的组合物与动物的眼、粘膜表面或伤口接触。

112.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求57所述的组合物与一种或多种动物的体液接触，所述体液选自血液、血清、泪液、肺部液体、肠液或鼻分泌液。

113.将生理活性剂持续释放到动物中的方法，该方法包括将权利要求57所述的组合物施用于人的鼻粘膜表面和分泌液中。

114.制备权利要求57所述的组合物的方法，该方法包括将生理活性剂、果胶质及一种或多种可选择的组分以任何顺序混合，并对该混合物进行加工，形成固体组合物。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述一种或多种可选择的组分包含增稠剂。

116.如权利要求114所述的方法，其中所述一种或多种可选择的组分包含聚乙烯吡咯烷酮。

117.如权利要求114所述的方法，其中将所述生理活性剂和果胶质溶于液体载体中，然后去除液体载体中的挥发性成分而形成固体组合物。

118.如权利要求114所述的方法，其中所述生理活性剂、果胶质及任何可选择的组分是固体，并作为固体进行混合加工。

119.如权利要求114所述的方法，其中所述可选择的组分包含固体的凝胶诱导剂，该固体的凝胶诱导剂包含一种或多种二价或多价金属阳离子的药学可接受的盐。

120.免疫动物的方法，该方法包括如下步骤：

a.提供一种或多种包含能够通过网孔直径约250μm网筛的粉末颗粒的粉末组合物，该粉末组合物包含：

i)甲基化程度低于约30％且平均分子量高于1×10⁵道尔顿的

一种或多种果胶质，该果胶质的量为当所述组合物与动物的粘膜表面接触时能够有效地形成凝胶的量；

ii)一种或多种抗原，所述抗原选自肽、蛋白、核酸、活细胞、死细胞或其部分、或病毒，所述抗原的量为能够诱导动物产生主动免疫应答的量；和

b.将所述粉末施用于动物的鼻组织和/或鼻液，以在与组织或体液接触时形成凝胶；以及

c.诱导动物对一种或多种抗原产生主动免疫应答。

121.如权利要求120所述的方法，其中所述果胶质是平均分子量超过约1.0×10⁶道尔顿的果胶的钠、钾或NH₄ ⁺盐。

122.如权利要求1所述的固体药物组合物，其中所述一种或多种阴离子多糖是平均分子量高于约1.0×10⁶道尔顿的果胶的钠、钾或NH₄ ⁺盐。

123.用于经鼻施用于动物的疫苗组合物，该组合物包含粉末颗粒，所述粉末颗粒包含下述成分的纳米分散体：

a.有效诱导动物免疫应答的量的一种或多种抗原；和

b.甲基化程度低于约30％且平均分子量高于约1×10⁵道尔顿的一种或多种果胶或其单价阳离子盐；

其中所述粉末颗粒能够通过网孔直径约250μm的网筛。

124.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述粉末颗粒是一种或多种抗原和一种或多种果胶或其单价阳离子盐的基本上均匀的固溶体。

125.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述果胶以水溶性单价阳离子盐形式存在，所述果胶在与动物鼻粘膜接触时与钙交联而形成凝胶。

126.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中至少约90％的所述粉末颗粒不能通过网孔直径约11μm的网筛。

127.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中至少约90％的所述粉末颗粒是粒径为约12μm～约60μm的微球体或微粒。

128.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种抗原独立地选自肽、蛋白、核酸、活细胞、死细胞或其部分、或者完整的病毒或其部分。

129.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种抗原包含至少一种流感抗原。

130.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种抗原包含

131.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种果胶独立选自平均分子量超过约1.0×10⁶道尔顿且甲基化程度低于约10％的果胶的钠、钾、NH₄ ⁺盐。

132.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述果胶质占该组合物重量的约0.01％～约10％。

133.如权利要求123所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种药学可接受的增稠剂。

134.如权利要求123所述的组合物，其中所述一种或多种增稠剂选自聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶原质、白明胶、葡聚糖、透明质酸或藻酸盐。

135.如权利要求123所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种增稠剂包含聚乙烯吡咯烷酮。

136.如权利要求123所述的疫苗组合物，该组合物进一步包含一种或多种药学可接受的单糖或二糖。

137.如权利要求136所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种药学可接受的单糖或二糖独立地选自核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇和海藻糖。

138.如权利要求136所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种药学可接受的单糖或二糖是乳糖。

139.如权利要求136所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种药学可接受的单糖或二糖以约10.0重量％～约99.9重量％存在。

140.如权利要求136所述的疫苗组合物，其中所述单糖或二糖以约50.0重量％～约99.5重量％存在。