DE10038043A1

DE10038043A1 - Phamakologisch wirksame Substanz zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen

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Publication number: DE10038043A1
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Publication date: 2002-03-07
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Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmakologisch wirksame Substanz zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen, insbesondere zur Prävention und Therapie von Arteriosklerose.

Description

Kardiovaskuläre Erkrankungen in Form von Herzinfarkt, Schlaganfall und periphe ren Gefäßverschlüssen zählen in den Industrienationen zu den Haupttodesursa chen. Die diesen Erkrankungen zugrundeliegende Arteriosklerose, d. h. die zu nehmende Gefäßeinengung, ist ein multifaktoriell über Jahrzehnte ablaufender Prozess, bei dem die Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen eine zen trale Rolle spielt. Neben Rauchen, Bluthochdruck und erhöhten LDL-(Low-Den sity-Lipoprotein)-Cholesterin-Konzentrationen zählen erniedrigte HDL-(High-Den sity-Lipoprotein)-Cholesterin-Konzentrationen zu den die Arteriosklerose begün stigenden Faktoren (D Gordon & BM Rifkind, (1989), New England Journal of Me dicine 321: 1311-1315).

Die Konzentration des Apolipoproteins A-I (Apo A-I), des Hauptstrukturproteins der HDL, stellt einen Indikator für das Risiko der Entwicklung kardiovaskulärer Er krankungen dar (JJ Maciejko, et al., (1983), New England Journal of Medicine, 309: 385-9; P Puchois, et al., (1987) Atherosclerosis, 68: 35-40). Dabei deuten niedrige Apo A-I Konzentrationen auf ein erhöhtes Risiko hin, während hohe Apo A-I-Konzentrationen auf ein eher niedriges Risiko schließen lassen.

LDL und HDL spielen bei der Ablagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen eine inverse Rolle. Während hohe LDL-Konzentrationen zu einer vermehrten Ab lagerung von Cholesterin in Gefäßwandzellen führen, indem sie Cholesterin zu den peripheren Zellen transportieren und damit die Arteriosklerose begünstigen, üben hohe HDL-Konzentrationen eine protektive, d. h. antiarteriosklerotische Wir kung aus.

Die antiarteriosklerotische Wirkung der HDL wird auf den sogenannten reversen Cholesterintransport (RCT; S Eisenberg, (1984), Journal of Lipid Research 25: 1017-1058) zurückgeführt, bei dem Cholesterin über eine HDL-Vermittlung aus peripheren Zellen mobilisiert wird, um anschließend zur Leber transportiert und dort zu Gallensäuren umgewandelt und über die Gallenflüssigkeit ausgeschieden zu werden.

Die Cholesterinaufnahme erfolgt entweder über einen diffusionsähnlichen Prozeß, der auch von anderen im Blut zirkulierenden Cholesterinakzeptoren, wie bei spielsweise Albumin, induziert werden kann, oder aber über einen HDL-spezifi schen, rezeptor-abhängigen Prozeß (WJ Johnson et al., (1991), Biochimica Bio physica Acta 1085: 273-298; GH Rothblat et al., (1999), Journal of Lipid Research 40: 781-796; JF Oram & S Yokoyama, (1997), Journal of Lipid Research 37: 2473-2482). Dabei erfolgt die Vermittlung der Rezeptorinteraktionen und die nachfol gende Aktivierung zellulärer Signalkaskaden durch das Apo A-I.

Die bekannten Therapiekonzepte zur Behandlung und zur Prävention von Arte riosklerose streben im wesentlichen die Reduktion der LDL und ihrer Vorläufer VLDL (Very-Low-Density-Lipoproteine) an. Dazu ist es beispielsweise bekannt, Fibrate oder Nikotinsäurederivate einzusetzen, die durch eine Verminderung der Synthese und durch einen verstärkten Abbau potentiell antherogener VLDL die Konzentration von Plasmatriglyzeriden und Plasmacholesterin senken. Die Appli kation dieser Substanzen weist lediglich als Nebeneffekt eine Steigerung der HDL-Konzentration auf, die möglicherweise darauf zurückzuführen ist, daß bei der Lipolyse der triglyzeridreichen VLDL- und HDL-Vorstufen generiert werden. Diese nehmen nachfolgend auch am RCT teil (J Shepherd, (1993), Postgraduate Medical Journal 69 Suppl 1: S34-41). Möglicherweise induzieren Fibrate zudem die Apo A-I Synthese (ML Kashyap, (1998), American Journal of Cardiology 82: 42U-48U).

Ebenso ist es bekannt, durch die Applikation von Ionenaustauscherharzen die Konzentration der potentiell antherogenen LDL zu senken. Dieser Effekt beruht im wesentlichen darauf, daß die Ionenaustauscherharze im Darm Gallensäuren binden, die damit dem enterohepatischen Kreislauf entzogen und vermehrt mit dem Stuhl ausgeschieden werden. Der somit erhöhte Entzug von Cholesterin induziert eine Steigerung der LDL-Rezeptorexpression in der Leber, was eine Konzentrationssenkung der LDL zur Folge hat. Aus nicht geklärten Ursachen wird bei diesem Therapieansatz auch die Apo A-I Synthese geringfügig induziert (J Sheperd, (1989), Cardiology 76 Suppl 1: 65-71).

In einem weiteren therapeutischen Ansatz wird durch die Applikation von sogenannten HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren ebenso versucht, über eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase, des Schlüsselenzyms der Choleristin Bio synthese, und über eine Steigerung der Expression der LDL-Rezeptoren in der Leber eine Senkung der LDL-Konzentration zu erreichen. Diese auch als Statine bezeichneten Substanzen können eine Reduktion des potentiell antherogenen LDL-Cholesterins bis zu 60% erzielen (D Waters, et al., (1996), American Journal of Medicine 101: 4A34S-38S; The Lancet, (1996), 348: 1339-1342; Cullen & G Assmann, (1997), American Journal of Cardiology 15: 1287-1294). Eine Modula tion der HDL-Konzentration durch die Applikation von Statinen erfolgt dagegen nicht, oder die Applikation dieser Substanzen weist lediglich als Nebeneffekt eine (geringgradige) Steigerung der HDL-Konzentration auf.

In einem weiteren Ansatz wird Probucol als Lipidsenker appliziert. Probucol mit seiner antioxidativen Wirkung wirkt einer chemischen Modifikation von Lipoprotei nen entgegen und senkt damit ihr atherogenes Potential. Damit geht jedoch eine sichtbare Senkung der positiven HDL-Konzentration einher.

Diese bekannten therapeutischen Konzepte greifen übereinstimmend an der Sen kung der LDL-Konzentration, d. h. des "schädlichen" Cholesterins bzw. der Vor läuferlipoproteine VLDL, an. Eine Steigerung der HDL, d. h. des "nützlichen" Cholesterins, erfolgt dabei bestenfalls in geringem Umfange als unbeabsichtigter Nebeneffekt oder aber es wird einer HDL-Steigerung sogar entgegengewirkt, wie beispielsweise durch die Applikation von Probucol. Eine gezielte Modulation des HDL ist nicht möglich und wird auch nicht angestrebt.

Alternative Strategien versuchen, einer Arteriosklerose-Entwicklung durch den Eingriff in den HDL-vermittelten reversen Cholesterintransport zu begegnen. Dazu wird beispielsweise rekombinant hergestelltes Apo A-I verwandt, das eine ver mehrte Cholesterinausscheidung mit dem Stuhl bewirkt (M Eriksson et al., (1999), Circulation 100: 594-598). Dazu muß das rekombinante Apolipoprotein in kurzen Abständen intravenös infundiert werden, so daß die Therapie schwierig ist.

Ebenso ist es bekannt, den RCT durch Erhöhung der zellulären Verfügbarkeit von freiem Cholesterin durch Inhibition des Enzyms ACAT (Acyl: CoA-Cholesterin- Acyltransferase) zu erhöhen. ACAT verestert freies Cholesterin in der Zelle und reduziert damit sein antherogenes Potential. Die Inhibition von ACAT beinhaltet somit einen potentiell positiven und einen potentiell negativen Aspekt. Der positive Effekt kommt dann zum Tragen, wenn das vermehrt anflalende freie Cholesterin auch quantitativ die Zelle verlassen kann. Die ACAT-Inhibition könnte jedoch ins besondere bei hohen LDL-Konzentrationen oder nicht ausreichender Effluxkapa zität zu einer Schaumzellbildung führen und damit die Arterioskleroseentwicklung sogar begünstigen.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Substanz zur Her stellung eines Arzneimittels und ein therapeutisches Konzept bereitzustellen, das eine verbesserte Therapie und Prävention von Arteriosklerose und die dadurch verursachten kardiovaskulären Erkrankungen, insbesondere Herzinfarkt, Schlag anfall und peripheren Gefäßverschlüssen, ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Serin/Threonin-Protein- Phosphatase-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prävention von Arteriosklerose und kardiovaskulären Erkrankungen.

Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, durch die Applikation von Se rin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren die Aktivität dieser Phosphatasen zu regulieren und damit den RCT zu stimulieren.

Die Stimulation des RCT durch Serin/Threonin-spezifische Protein-Phosphatase- Inhibitoren beruht dabei auf folgendem Mechanismus:
Die Cholesterinmobilisierung über den RCT setzt voraus, daß HDL-assoziiertes oder freies Apo A-I an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor binden und damit membranständige Lipasen, beispielsweise die Phospholipasen C und D sowie Adenylzyklasen aktivieren kann. Dadurch entstehen Second-Messanger wie Diacylglycerin (DAG), Phosphatidsäure (PA) und cAMP. Diese aktivieren an schließend Proteinkinasen, beispielsweise die Serin/Threonin-spezifische Pro teinkinase C, die anschließend die Phosphorylierung mindestens fünf verschiedener Phosphoproteine induzieren kann, u. a. auch des ATP-Kassettentransporters ABC-1. Die Phosphorylierung dieser Proteine aktiviert den Transport intrazellulär gespeicherten Cholesterins zur Zelloberfläche, von wo das Cholesterin von freiem Apo A-I oder unspezifischen Cholesterinakzeptoren, wie beispielsweise Albumin aufgenommen und zur Leber transportiert werden kann.

Eine andere Gruppe von Enzymen, die sogenannten Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatasen (Ser/Thr-PPs) können diese Signalkaskade regulieren, in dem sie die Serin/Threonin-Aminosäurereste dephosphosphorylieren und somit die entsprechenden Enzyme in ihrer Aktivität kontrollieren (D Barford, (1996), Trends in Biochemical Science 21: 407-412).

Der Kern der Erfindung liegt nun darin, diese Serin/Threonin-spezifischen Protein phosphatasen zu inhibieren, und somit den Transport des Cholesterins aus der Zelle zu erhöhen.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Serin/Threonin-spezifischen Protein- Phosphatase-Inhibitoren (nachfolgend auch Ser/Thr-PP-Inhibitoren) kann den Cholesterin-Netto-Efflux deutlich erhöhen. Diese Erhöhung kann beispielsweise das 6- bis 8-fache des Effluxes von unbehandelten Zellen betragen. So konnte gezeigt werden, daß die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren in kultivierten menschlichen Fibroblasten innerhalb einer nur 2-stündigen Inkubationszeit zu einer Mobilisierung von bis zu 30% des gesamten zellulären Cholesterins führen kann, was - verglichen mit dem Efflux ausschließlich in Anwesenheit von Albumin - einer 6-fachen Steigerung gleichkommt. Eine 8-fache Steigerung der Mobilisie rung intrazellulär gespeicherten Cholesterins in Albumin-haltiges Medium kann durch Pulse-Chase-Inkubation mit ¹⁴C-Mevalonolacton oder ¹⁴C-Acetat nachge wiesen werden.

Unterhalb eines Sättigungsbereiches können die Serin/Threonin-spezifischen Protein-Phosphatase-Inhibitoren eine konzentrationsabhängige Wirkung zeigen, die im nanomolaren bis mikromolaren Bereich liegt, so daß eine pharmakologi sche Nutzung möglich ist.

Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung liegt darin, daß die Ser/Thr-PP-Inhibitoren in der Spezifität und Effektivität ihrer Wirkung dem Apolipo protein-I entsprechen und sogar es in seiner Effektivität übertreffen können. Dar aus ergibt sich der weitere Vorteil, daß eine Modulation der den spezifischen Cholesterin-Efflux induzierenden Signalkaskade durch die Ser/Thr-PP-Inhibitoren möglich sein kann. So kann in kultivierten Zellen durch die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren eine Hyperphosphorylierung derselben Proteine erreicht werden, die auch durch Apolipoprotein-I phosphoryliert werden. Dabei kann es sich beispielsweise um 5 Phosphoproteine mit jeweils 14, 18, 65, 71 oder 250 kD handeln, von denen das 250 kD Protein als ATP-Kassettentransporter identifiziert wurde. Des weiteren kann durch Ser/Thr-Kinase-Inhibitoren swohl die Wirkung von Apo A-I als auch von Ser/Thr-PP-Inhibitoren inhibiert werden.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP-Inhibito ren besteht in ihrer antiproliferativen Wirkung. Dies kann insbesondere dann posi tiv genutzt werden, wenn die antiproliferative Wirkung der Ser/Thr-PP-Inhibitoren die mitogene Wirkung des HDL ausgleichen kann. Dieser Effekt kann gerade bei der Beeinflussung der Pathogenese von Arterioskleroseentwicklung nutzbringend eingesetzt werden, da Wachstumsprozesse dabei eine wesentliche Rolle spielen. Da die Ser/Thr-PP-Inhibitoren eine noch weitaus stärkere antiproliferative Wirkung als Apo A-I zeigen und z. B. den Bromdeoxyuridin-Einbau in replizierende DNA noch mindestens 2-3-fach effektiver hemmen können als Apo A-I, kann die erfin dungsgemäße Verwendung darüber hinaus vorteilhaft in der Behandlung anderer proliferativer Prozene, also z. B. von malignen Tumoren und gutartigen Geschwül sten, eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung kann nicht nur vorteilhaft in der Prävention arteriosklerotischer Veränderungen und damit zur Prävention von kardiovaskulä ren Ereignissen eingesetzt werden, sondern kann aufgrund ihres Wirkprinzips auch dem Abbau bereits bestehender Gefäßwandveränderungen und arterios klerotischer Plaques und von anderen pathologischen Lipidansammlungen, bei spielsweise im Rahmen von Lipidspeichererkrankungen, dienen.

Des weiteren kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Tangier-Krankheit verwendet werden. Der Tangier-Krankheit liegt ein zellulärer Defekt der Apo A-I-vermittelten Chole sterinmobilisierung und der HDL-Bildung zugrunde, womit eine Störung der Apo A-I-vermittelten Signalübertragung verbunden ist (M Walter et al., (1994), Bio chemical, Biophysical Research Communications 205: 850-856; Francis, et al., (1995), Journal of Clinical Investigation 96: 78-87; M. Walter et. al. (1996), Journal of Clinical Investigation 98: 2315-2323). Dies kann beispielsweise auf eine durch eine Stop-Kodon-Mutation verursachte ABC-1-Defizienz zurückgehen. Beispiels weise bei Tangier-Patienten, die noch Restaktivitäten im spezifischen Cholesterin- Efflux aufweisen, wie z. B. Patienten mit heterozygoten Mutationen ober bei Muta tionen, die nicht mit einer kompletten Funktionseinbuße des ABC-1 einhergehen, kann die Applikation von Ser/Thr-PP-Inhibitoren erhebliche therapeutische Ver besserungen eröffnen. Da Ser/Thr-PP-Inhibitoren auch bei komplettem ABC-1- Mangel noch eine erhebliche Restaktivität bei der Cholesterineffluxverstärkung von mind. 60% aufweisen können, ist darüber hinaus auch die Therapie von ho mozygoten Tangier-Patienten möglich.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Ser/Thr-PP-Inhibitoren mit weiteren pharmakologisch wirksamen Substanzen kombiniert, beispielsweise mit ACAT-Inhibitoren, da die daraus resultierenden Synergieeffekte die Therapie arteriosklerotischer Erkrankungen erheblich verbessern können. Diese beruhen im Falle der ACAT-Inhibitoren auf der erhöhten Verfügbarkeit des zellulären Chole sterins, das durch die Applikation der Ser/Thr-PP-Inhibitoren anschließend ver stärkt aus der Zelle abtransportiert werden kann.

Auch die Kombination mit Statinen kann zu einer deutlichen Verbesserung der Therapie führen. Statine nämlich, wie bereits ausgeführt, senken den Anteil des "schädlichen" Cholesterins, während sie die HDL-Konzentration kaum beeinflus sen. Da die Ser/Thr-PP-Inhibitoren ihrerseits, wie das Apo A-I, den spezifischen Cholesterin-Efflux induzieren, wird durch die simultane Applikation von Ser/Thr- PP-Inhibitoren und Statinen der für die Ausprägung arteriosklerotischer Erkran kungen wesentliche Quotient aus LDL-Cholesterin und HDL-Cholesterin positiv beeinflußt. Er kann in besonders vorteilhafter Weise zur Abschätzung des Er krankungsrisikos herangezogen werden.

Besonders vorteilhaft kann die Kombination eines oder mehrerer Ser/Thr-PP-Inhi bitoren mit Medikamenten sein, die als (unerwünschte) Nebenwirkung eine HDL- Konzentrationserniedrigung aufweisen, wie z. B. der Lipidsenker Probucol, aber auch andere Medikamente bzw. Hormone, wie Gestagene, Androgene, Korti koide, β-Blocker und Thiaziddiuretika, da eine niedrige HDL-Konzentration und Ser/Thr-PP-Inhibitoren synergistische Effekte zeigen können. Diese können kon zentrationsabhängig variieren, und sind beispielsweise bei niedrigen Konzentra tionen der Inhibitoren stärker ausgeprägt als bei hohen Konzentrationen.

Aufgrund des vorgenannten Synergieeffektes bei niedrigen HDL- und Inhibitor- Konzentrationen können Ser/Thr-PP-Inhibitoren auch vorteilhaft bei anderen HDL- Mangel-Syndromen eingesetzt werden, wie z. B. Apo A-I-Synthesedefekten, Apo A-I-Mutationen mit herabgesetztem HDL-Cholesterin, LCAT (Lecithin: Cholesterin- Acyltransferase)-Mangel der Fish-Eye-Erkrankung, einem Lipoproteinlipase- Mangel oder anderen HDL-Mangel-Syndromen.

In einer weiteren vorteilhaften Verwendung können Ser/Thr-PP-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Diabetes mellitus verwendet werden. Auch hier können Ser/Thr-PP-Inhibitoren der häufig bei Diabetes-Patien ten beobachteten stark erniedrigten HDL-Cholesterin-Konzentration entgegenwir ken und so die damit einhergehende vorzeitige Arterioskleroseentwicklung positiv beeinflussen.

Diese Wirkung kann darauf zurückgeführt werden, daß die Ser/Thr-PP-Inhibitoren in menschlichen Fibrolasten, die Phosphorylase-Phosphatase, als wichtiges Re gulatorenzym des Gluctosestoffwechsels konzentrationsabhängig verstärken. Hinsichtlich der Effektivität weisen einzelne Inhibitoren Unterschiede auf, d. h. so ist Calyculin effektiver als Okadsäure, und das wiederum effektiver als Canthari din. Es kann daraus abgeleitet werden, daß Ser/Thr-PP-Inhibitoren in menschli chen Haut-Fibrolasten nicht nur die zelluläre Cholesterinhomöostase, sondern auch die Glucosehomöostase beeinflussen, und daß die Beeinflussung der Glucosehomöostase über dieselben Signalwege vermittelt werden, über die auch das Apo A-I einen Cholesterinefflux induziert.

Vorteilhafterweise können Ser/Thr-PP-Inhibitoren somit auch nutzbringend in der Therapie anderer Symptome des Diabetes eingesetzt werden, beispielsweise bei einer auf eine erhöhte Aktivität Ser/Thr-spezifischer Proteinphosphatasen zurück gehenden Pathogenese des nicht-insulin-abhängigen Diabetes und einer ver mehrten Glykogeneinlagerung einschließlich des damit verbundenen Überge wichts (RN Margolis (1987), Life Sciences 41: 2615-2622).

Ein weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung der Ser/Thr-PP-Inhibitoren besteht in ihrer eine Hyperphosphorylierung der ATRP- Kassettentransportern, insbesondere des ABC-1 induzierenden Wirkung.

Erkrankungen, die im wesentlichen auf einen Defekt eines ATP abhängigen Transports zurückzuführen sind, genutzt werden. Erfindungsgemäß können daher Ser/Thr-PP-Inhibitoren vorteilhaft in therapeutischen Ansätzen zur Behandlung der Cystischen Fibrose, der Adrenoleukodystrophie, der Retinitis pigmentosa, der Sideroblastenanämie, der Ataxie, Stargardt-Krankheit und anderer erblicher intrahepatischer Cholestasen verwendet werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Krankheitsbildern und Defekten in ATP-Kassettentransportern ist in der Literatur beschrieben: T Hoof, et al., Journal of Biological Chemistry 269: 20575-20583; V Feigenbaum, et al., (1996), Am J Hum Genet 58: 1135-1144; DG Birch, (1999), Mol Genet Metab 66: 356-366; R Allikments, et al., (1999), Hum Mol Genet 8, 743-749; R Lewis et al., (1999), Am J Hum Genet 64: 422-434; SS Strautnieks, et al., (1998), Nat Genet 20: 233-238; M Wada, et al., Hum Mol Genet 7: 203-207.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Ser/Thr-PP-Inhibitoren aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt: Cantharidin, Calyculin, Okadasäure, Endothall sowie deren Derivate, beispielsweise das Norcantharidin.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, denen fol gende Methodik zugrundeliegt:

1. Verwendete Zellen

Menschliche Fibroblasten gesunder Kontrollpersonen und zweier homozygoter Tangierpatienten, sowie Makrophagen der Zellinie THP-1 für die Immunpräzipita tion von ABC-1 und Cholesterineffluxmessungen, werden mit üblichen Verfahren gewonnen. Die Gewinnung und Präparation der Fibroblasten ist in verschiedenen Publikationen beschrieben, z. B. M Walter et al., (1995), Arteriosclerosis, Throm bosis and Vascular Biology, 15: 1975-1986; M Walter et al., (1996), Journal of Cli nical Investigation 98: 2315-2323; M Walter et al., (1994), Biochemical, Biophysical Research Communications, 205: 850-856.

Die Cholesterinbeladung der etwa 90% konfluenten Zellen erfolgt 48 h bei 37°C in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) in Anwesenheit von Fibroblasten Basalmedium (Bio Whittacker), 0.5 mM Mevalonolacton, 1 mg/ml bovinem Seru malbumin und 1% Antibiotika/Antimykotika-Lösung (Sigma).

2. Präparation der Lipoproteine und des Apolipoprotein A-I

HDL₃, die Apo A-I-haltige Hauptfraktion der HDL, wird mittels differentieller Ultra zentrifugation (d = 1.125-1.210 g/ml) aus frischem menschlichen Plasma isoliert und gegen 0.3 mM Tris-HCl Puffer (pH 6.8), 0.15 M NaCl, dialysiert. Apo A-I wird mittels HPLC präpariert, wie in A von Eckardstein et al., (1990), Journal of Biologi cal Chemistry 265: 8610-8617 beschrieben.

3. Cholesterineffluxmessungen

Nach Cholesterinbeladung der Zellen mit dem Cholesterinvorläufermolekül Meva lonolacton werden die Zellen mit PBS-Albumin (PBS mit 1 mg/ml Albumin) gewa schen und für 2 h bei 37°C in bikarbonatfreiem DMEM-Hepes, 1 mg/ml Albumin mit unterschiedlichen Konzentrationen HDL, Apo A-I oder entsprechendem Phosphatase-Inhibitor inkubiert. Nach der zweistündigen Inkubationszeit werden die Effluxmedien gesammelt, die Zelllayer werden mit 1 ml PBS-Albumin gewa schen und die Waschlösung jeweils mit den Effluxmedien vereinigt. Die Choleste rinmasse in den Effluxmedien wird mit Gaschromatographie nach P Cullen et al., (1997), Analytical Biochemistry, 251: 39-44 gemessen. 5 µg 5b-cholestan-3a-ol wird zu den Effluxmedien als interner Standard addiert. Nach Derivatisierung mit Trimethylsiylether wird die Cholesterinmessung mit einem Dani 8521 Gaschro mathographen (Monza, Italien) vorgenommen, ausgestattet mit einem program mierbaren Injektor (PTV), einer CP-Wax 57CB Silikakapillarsäule (25 m × 0.32 mm ID, 0.2 µm Filmdicke, Chromspec, Bridgewater, NJ), einem Flammenionisations detektor und einem Chromatogramm Datenprozessor MT2 (Kontron, Neufahrn). Das zelluläre freie und veresterte Cholesterin wird nach P Cullen et al., (1997), Journal of Lipid Research, 38: 401-409 in der HPLC-Methodik getrennt, wobei eine Kontron Anlage (Neufahrn, Deutschland) und eine 3 µm Spherisorb ODS2 250 × 4 mm Säule (Phase Separations, Queensferry, UK) eingesetzt wird. Die Mobilisierung intrazellulär gespeicherten Cholesterins wird nach dünnschichtchro matographischer Auftrennung der Cholesterinderivate in Effluxmedium und Zellextrakten und Auswertung mittels Phosphoimager vorgenommen, nachdem die Zellen zuvor mit 10 µCl ¹⁴C-Acetat oder ¹⁴C-Mevalonolacton mittels Pulse- Chase-Technik markiert werden, wie in M Walter et al., (1994), Biochemical, Bio physical Research Communications, 205: 850-856 beschrieben.

Calyculin, Cantharidin, Okadasäure, Tyrphostin A25 oder Vanadat können von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen werden. Alle Radionuklide kön nen von Amersham (Braunschweig, Deutschland) geliefert werden. Alle anderen Reagenzien sind bei Sigma (Deisenhofen, Deutschland) in der höchstmöglichen Reinheit erhältlich.

4. Nachweis der Phosphoproteine

Die Zellen werden zweimal in phoshatfreier Lösung (Na⁺-Hepes-Puffer), beste hend aus 132 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 10 mM Glukose, 10 mM He pes und 2.5 mM Natriumpyruvat, pH 7.4, bei 37°C gewaschen und mit 5 mCi ³²P- markiertem Orthophosphat für 2 h bei 37°C inkubiert.

Nach einer 30-minütigen Inkubationsperiode bei 37°C wird die Reaktion mit SDS- Lösung, bestehend aus 62.5 mM Tris, 10% SDS (w/v), 10% Glyzerin (v/v), 0,6% DL-Dithiothreitol (w/v) und Spuren von Bromphenolblau, pH 6.8, gestoppt. Die Proben werden nach kurzer Erhitzung auf 95°C in 100 µl Aliquots (entsprechend 20-30 µg Protein) auf ein 5%-iges, ein 7.5%-iges und ein 10%-iges SDS-Gel auf getragen. Die Gele werden nach dem Lauf getrocknet, und die in die jeweiligen Phosphoproteine inkorporierte Radioaktivität wird mit einem Phosphoimager quantifiziert und mit der ImageQuant Software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) ausgewertet (J Neumann et al., (1993), American Journal of Physiology 265: H257-266). ABC-1 wird in ³²P- und ³³P-markierten Zellextrakten mit Hilfe eines Antipeptid Antikörpers durch Immunfällung und anschließender elektrophoreti scher Auftrennung identifiziert. THP-1 Monozyten von der American Type Culture Collection werden mit Azetyl-LDL (100 µg/ml; 24 h) cholesterin-beladen. Die Zel len werden mit 100 µCl/ml ³³P für 4 h markiert, gewaschen und mit den Phos phatase-Inhibitoren 30 min inkubiert. Die Reaktion wird durch Zufügen von 0.05 M NaOH gestoppt.

5. Messung des Zellwachstums

Der Einfluß von Apo A-I, HDL und Phosphatase-Inhibitoren auf das Wachstum der Zellen wird durch Messung der DNA-Synthese verfolgt. Hierzu wird der Brom deoxyuridin (BrdU) Einbau in DNA mit Hilfe eines ELISA-Testkits quantifiziert (Roche, Mannheim). Fibroblasten werden in den ELISA Vertiefungen ausgesät und in DMEM, 10% FCS für 6 h inkubiert. Nach Waschen der Zellen und Inkuba tion in DMEM, 1 mg/ml Albumin für 20 h wird eine nochmalige 20 h Inkubation in Anwesenheit von HDL, 10% FCS, Apo A-I oder Albumin (Kontrolle) angeschlos sen. Entsprechend der Vorschrift des Herstellers wird der Peroxidase-gekoppelte Antikörper für 2 h zugegeben. Die Einbaurate wird mittels Immunfluoreszenz mit einem Dynatech MR600 Gerät bei 450 nm gemessen.

6. Messung der Phosphorylase-phosphatase Aktivität

Die Phosphorylase-phosphatase Aktivität wird durch Freisetzung von ³²P aus Phoshorylase a in Fibroblasten-Homogenaten in Ab- und Anwesenheit verschie dener Inhibitor-Konzentrationen gemessen, entsprechend einer etablierten Me thodik (J. Neumann et al., (1993), American Journal of Physiology 265: H257-266). Das Inkubationsgemisch enhält 0,1 mM EDTA, 5 mM Caffein, 20 mM Tris HCl (pH 7.0 bei 37°C) und 0,1% β-Mercaptoethanol. Die Reaktion wird durch Zugabe von Homogenat gestartet und durch Zugabe von 50% Trichloressigsäure gestoppt. Das präzipitierte Protein wird abzentrifugiert (14000 g, 4°C, 5 min) und die Radio aktivität wird in TriCarb (Ganbesra-Packard) gemessen.

Beispiele Beispiel 1 Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf den Cholesterinefflux aus menschlichen Fibroblasten

Dargestellt ist der Netto-Cholesterinausstrom aus menschlichen Fibroblasten 4 h nach Zugabe von Apo A-I oder Ser/Thr-PP-Inhibitoren in Anwesenheit von 1 mg/ml Albumin. Die gesamte Cholesterinmasse im Zellkulturüberstand wird mittels Gaschromatographie gemessen. Der Cholesterinausstrom in Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert. Der 100% Wert liegen bei 1.7 µg Cholesterin pro mg Zellprotein. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standar dabweichung (n = 4).

In Fibroblasten des Tangier-Patienten TD1 mit kompletter ABC1-Defizienz (Patient beschrieben in: S Rust et al., (1999), Nature Genetics 22: 352-355) ist die durch Ser/Thr-PP-Inhibitoren verursachte Cholesterineffluxsteigerung ab geschwächt, aber noch vorhanden. In Fibroblasten des Tangier-Patienten TD2 mit inkomplettem Defekt (Patient beschrieben in: M Walter et al., (1994), Bio chemical, Biophysical Research Communications 205: 850-856) ist die durch Ser/Thr-PP-Inhibitoren verursachte Cholesterineffluxsteigerung nicht oder nur insignifikant vermindert.

Beispiel 2 Einfluß von HDL, Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren auf den zellulären Cholesteringehalt

Fibroblastenkulturen werden in 60-mm Zellkulturplatten bis zur Präkonfluenz an gezüchtet und mit der Cholesterinvorstufe Mevalonolacton beladen. Die Kulturen wurden in DMEM inkubiert, entweder ohne Zusatz oder mit 1 mg/ml Rinderalbumin plus die angegebenen Konzentrationen HDL, Apo A-I, Calyculin A, Canthari din, Okadasäure für 4 h bei 37°C. Nach der Inkubation wurden freies Cholesterin (FC) und verestertes Cholesterin (VC) mit der oben beschriebenen HPLC-Metho dik gemessen. Das Gesamtcholestrin (GC) wird aus der Summe von FC und VC Masse gebildet. Die Cholesterinmasse wird als µg Cholesterin pro mg Zellprotein angegeben. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± S. D. von drei Kulturplatten. Die Veränderung der Cholesterinmasse (Δ) wird als Differenz zwischen Cholesterin- beladenen Zellen, jeweils mit und ohne Additiv, berechnet (in Klammern sind die relativen Veränderungen in % angegeben). * p < 0.05, ** p < 0.01, verglichen mit Cholesterin-beladenen Zellen ohne Additiv.

Beispiel 3 Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf die Mobilisierung intrazellulären Cholesterins

Dargestellt ist der Ausstrom von de novo synthetisiertem intrazellulärem Choleste rin aus menschlichen Fibroblasten 4 h nach Zugabe von Apo A-I oder Ser/Thr-PP- Inhibitoren in Anwesenheit von 1 mg/ml Albumin. Die Markierung intrazellulären Cholesterins erfolgt mit [¹⁴C]-Mevalonolacton. Der Cholesterinausstrom in Anwesenheit von Albumin allein wird als 100% Wert definiert, gemessen in dpm. Angegeben ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5).

Beispiel 4 Einfluß verschiedener Agonisten (Albumin, Apo A-I und Ser/Thr-PP-Inhibitoren) auf das Wachstumsverhalten von Fibroblasten

Das Zellwachstum wird mit Hilfe eines ELISA-Kits durch BrdU Einbau in replizie rende DNA gemessen. Die Inkorporationrate wird durch Quantifizierung der Im munfluoreszenz eines Peroxidase markierten Anti-BrdU Antikörpers bestimmt (bei 450 nm). Der 100% Wert entspricht der Inkorporationsrate in Anwesenheit von Al bumin.

Fig. 1

Die Fig. 1a zeigt den Einfluß von Ser/Thr-PP-Inhibitoren auf den Phosphorylie rungsgrad Apo A-I-sensitiver Phosphoproteine (das heißt von Proteinen, die durch Apo A-I phosphoryliert werden). Der Phosphorylierungsgrad wird nach einer 30- minütigen Inkubation in Anwesenheit von Calyculin A (▲), Okadasäure (∎) oder Cantharidin (○) gemessen. Der basale Phosphorylierungsgrad (in Anwesenheit von Albumin) wird als 100% Wert definiert.

Die Fig. 1b zeigt den Einfluß von Cantharidin (CANT) auf Apo A-I-sensitive Phosphoproteine in Fibroblasten einer gesunden Kontrollperson und eines homo zygoten Tangierpatienten mit kompletter ABC1-Defizienz in unbeladenen und Cholesterin-beladenen (CHOL +) Zellen. Insbesondere in Cholesterin-beladenen Zellen induziert Cantharidin eine verstärkte Phosphorylierung der Apo A-I-sensiti ven Phosphoproteine und verhält sich in dieser Hinsicht wie Apo A-I. In Tangier zellen ist die ABC-1-Phosphorylierung aufgrund einer kompletten ABC1-Defizienz bei diesem Patienten völlig aufgehoben. Die anderen Apo A-I-sensitiven Phos phoproteine werden auch in Tangierzellen zumindest partiell phosphoryliert. Diese Proteine sind bislang nicht identifiziert und daher mit ihrem geschätzten Moleku largewicht angegeben.

Fig. 2

Die Fig. 2 zeigt den Einfluß von Calyculin A (a), Okadasäure (b) und Cantharidin (c) auf die Phosphorylase Phosphatase Aktivität in Zellhomogenaten humaner Hautfibroblasten. Die Phosphorylase Phosphatase Aktivität wurde wie im Textteil beschrieben gemessen und als % der Kontrolle (DMSO) angegeben.

Claims

1. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren in einer Zu sammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung arteriosklerotischer Erkrankungen.

2. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach An spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Serin/Threonin-Proteinphos phatase-Inhibitoren aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt sind: Cantharidin, Calyculin, Okadasäure, Endothall, Norcantharidin sowie Derivate der vorgenannten Substanzen.

3. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach An spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine weitere pharmakologisch wirksame Substanz hinzugesetzt wird.

4. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren nach An spruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmakologisch wirksame Substanz aus der Gruppe folgender Substanzen ausgewählt ist: Statine, ACAT-Inhibitoren, HDL, HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, Probucol.

5. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung von HDL-Mangel-Syndromen.

6. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung ei ner Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe folgender Erkrankungen: Syn drome verursacht durch Apo A-I-Synthesedefekte oder Apo A-I-Mutationen, LCAT (Lecithin: Cholesterin-Acyltransferase)-Mangel, Fish-Eye-Erkrankung, Lipoproteinlipase-Mangel.

7. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung auf Defekten von ATP-Kassettentransportern beruhender Erkrankungen.

8. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung von Diabetes mellitus.

9. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung gutartiger Geschwulste.

10. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung maligner Tumore.

11. Verwendung von Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitoren zur Herstel lung eines Arzneimittels zur therapeutischen und präventiven Behandlung ei ner Krankheit ausgewählt aus der Gruppe folgender Erkrankungen: Cystische Fibrose, Adrenoleukodystrophie, Retinitis pigmentosa, Sideroblastenanämie, Ataxie, Stargardt-Krankheit und erblichen intrahepatischen Cholestasen.