DE69534564T2

DE69534564T2 - Verwendung von 2-hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-derivaten als wirkstoffe zur chemoprävention und chemotherapie von kolonkrebs

Info

Publication number: DE69534564T2
Application number: DE69534564T
Authority: DE
Inventors: Lorin K. Johnson; Marvin H. Sleisenger
Original assignee: Salix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Salix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-01-07
Filing date: 1995-01-06
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2015-01-07
Also published as: EP0738152B1; FI962735A; ATE308327T1; NZ279062A; CA2180571C; AU1557595A; HUT74512A; NO962841D0; NO962841L; EP0738152A4; WO1995018622A1; HU9601846D0; CZ196796A3; JP2006096738A; AU691869B2; US5498608A; DE69534564D1; JP2010235629A; DK0738152T3; JP2005320326A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Chemoprophylaxe und Chemotherapie von Darmkrebs (Kolon-Karzinom).
Technischer Hintergrund
Kolonkrebs ist derzeit in den USA jährlich für 11% sämtlicher Todesfälle aufgrund von malignen Erkrankungen verantwortlich. Mit einer Inzidenz von 62 pro 100 000 und einer Prävalenz von 300 pro 100 000 stellt die Krankheit derzeit die dritthäufigste Todesursache bei Männern und die vierthäufigste Todesursache bei Frauen dar. Kolon-Karzinom weist eine besonders schlechte Fünfjahresüberlebensrate von weniger als 50% auf, was auf das späte Stadium zurückzuführen ist, in dem die Diagnose im allgemeinen gestellt wird. Mit der derzeit favorisierten Behandlung, nämlich eines chirurgischen Eingriffes in Kombination mit Chemotherapie, ist es nicht gelungen, diese Überlebensrate zu erhöhen. Es wird eine sichere und wirksame präventive Therapie benötigt, die bei Patientenpopulationen, bei denen ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Kolon-Karzinom besteht, früh eingeleitet werden kann.
Eicosanoide und differenzierte Funktionen von gastrointestinalen Zellen. Eicosanoide sind signifikante Regulatoren des Wachstums, der Differenzierung und der Funktion von gastrointestinalen Epithelzellen. Eicosanoid-Produkte der Prostaglandin-Reihe induzieren bekanntlich eine Schleimsekretion (Beckel and Kauffman, Gastroenterology, Bd. 80 (1981), S. 770–776) und die Sekretion von Elektrolyten und Flüssigkeit (Miller, Am. J. Physiol., Bd. 245 (1983), S. G601–G623). Sie induzieren auch den aktiven Transport (Bukhave und Rask-Madsen, Gastroenterology, Bd. 78 (1980), S. 32–37) und erhöhen die replikative Kapazität des Epithels (Konturek et al., Gastroenterology, Bd. 80 (1981), S. 1196–1201). Diese Reaktionen führen zur Aufrechterhaltung eines differenzierten, schützenden Barrieresystems von eng verbundenen Epithelzellen, deren apikale Oberfläche durch einen dichten chemischen Glycokonjugat-Puffer bedeckt ist. Im Magen und im oberen Zwölffingerdarm schützt eine derartige Barriere gegen die saure und proteolytische Umgebung, die speziell für die Verdauung bestimmt ist, während sie im Kolon einen Schutz gegen das Eindringen von Bakterien und Toxinen bietet. Es ist daher nicht überraschend, dass exogene, synthetische Prostaglandine eine aktive zellschützende Funktion ausüben (Whittle und Vane, in: Johnson (Hrsg.) PHYSIOLOGY OF THE GASTROINTESTINAL TRACT, Bd. 1, 2. Auflg., New York (1987), Raven Press, S. 143–180) und eine therapeutische Anwendung als sekundäre Antiulcus-Behandlungsmittel gefunden haben. Das gastrointestinale System ("GI"-System) hat sich daher so entwickelt, dass es in aktiver Weise ein spezifisch differenziertes Komplement von Eicosanoid-Produkten, die in der lokalen Umgebung vorliegen, produziert und sich auf dieses stützt. Da sich sämtliche Eicosanoide vom gemeinsamen Vorläufer Arachidonsäure ableiten, die ihrerseits aus Membran-Phospholipiden freigesetzt werden, weisen mukosale GI-Zellen ein relativ hohes Grundniveau des Arachidonat-Turnovers auf, der durch das Enzym Phospholipase A2 (PLA2) initiiert wird.
Das GI-System stellt ferner einen primären Abwehrmechanismus gegen Bakterien, Antigene und Toxine in der Umgebung dar und muss daher auch die Fähigkeit besitzen, für eine aggressive und rasche entzündliche Reaktion zu sorgen. Diese Reaktion stützt sich auch auf Eicosanoid-Produkte sowohl der Prostaglandin-Reihe (PG-Reihe) als auch der chemotaktischen Leukotrien-Reihe (LT-Reihe) und führt zum Zustrom von Neutrophilen, Makrophagen und Immunzellen aus dem Blut in Reaktion auf das Aktivierungsmittel. Jede dieser eindringenden Zellen bringt auch eine Fähigkeit zur Metabolisierung seiner eigenen Phospholipide sowie von mukosalen und luminalen Phospholipiden mit sich, indem sie entzündliche (sezernierte) PLA2 freisetzen, um die Freisetzung von Arachidonsäure zu verstärken, die dann sowohl zur PGs als auch LTs metabolisiert wird.
Obgleich die entzündliche Zellinfiltration den verletzenden Stimulus begrenzt und beseitigt, ist das Ausmaß der Schädigung aufgrund der entzündlichen Zellfreisetzungsprodukte erheblich. Neutrophile und Makrophagen setzen Superoxid (O₂ ^–) (Kitahora et al., Dig. Dis. Sci., Bd. 33 (1988), S. 951–955) sowie Wasserstoffperoxid (H₂O₂) (Tauber und Babior, Free Radic. Biol. Med., Bd. 1 (1985), S. 265–307) und Proteasen (Ohlsson et al., Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem., Bd. 358 (1977), S. 361–366) frei. Sofern die sich ergebende Infiltration ausgedehnt ist, kommt es zu einer erheblichen Entblößung der Epithelschicht unter anschließender Beeinträchtigung der Barrierefunktion. Es ist dann eine Auflösung der entzündlichen Reaktion erforderlich, um schließlich eine optimale Bedeckung mit der epithelialen Barriere wieder zu erreichen.
Chronische GI-Entzündung und GI-Krebsinduktion
Es ist derzeit gut dokumentiert, dass chronische, gastrointestinale, entzündliche Krankheiten, wie ulzerative Kolitis (Lennard-Jones et al., Gastroenterology, Bd. 73 (1977), S. 1280–1285), Morbus Crohn (Farmer et al., Cancer, Bd. 28 (1971), S. 289–295) und chronische, atrophische Gastritis (Sipponen et al., Cancer, Bd. 52 (1983), S. 1062–1067) mit einem erhöhten Risiko eines anschließenden gastrointestinalen Karzinoms verbunden sind. Obgleich die Mechanismen noch nicht nachgewiesen worden sind, treten während mehrfacher akuter entzündlicher Episoden drei wichtige, sich gegenseitig schneidende Wege auf, die zu einer anschließenden Transformation, erhöhten Proliferation und malignen Invasion führen können. Wie nachstehend erläutert, handelt es sich um: (1) eine erhöhte Belastung des Kolons mit freien Radikalen und Karzinogenen, (2) eine veränderte Regulierung von trophischen Eicosanoiden und (3) eine Induktion von Genprodukten, die eine zelluläre Invasion vermitteln.
Veränderte Karzinogen-Belastung aufgrund von entzündlichen Episoden
Das Kolon kann in besonderer Weise einer ziemlich hohen Grundbelastung mit genotoxischen Karzinogenen und Tumor-Promotoren ausgesetzt sein, die aus dem Metabolismus von diätetischen Verbindungen und endogenen Ausscheidungen, wie Gallensäuren, durch Kolon-Bakterien stammen. Eine Beziehung zwischen fäkalen Karzinogenen und der Induktion von Kolon-Karzinom wird durch das Auffinden von vermehrten Mutagenen im Stuhl von Personen mit hohem Risiko im Vergleich zu Populationen mit geringem Risiko gestützt (Reddy et al., Mut. Res., Bd. 72 (1980), S. 511–515). Diese Korrelation stimmt auch mit wiederholten Befunden überein, die eine negative Assoziation zwischen der Aufnahme von diätetischen Fasern und der Inzidenz von Kolon-Karzinom zeigen (Armstrong und Doll, Int. J. Cancer, Bd. 15 (1975), S. 617–623). Es wird postuliert, dass die Schutzwirkung von Fasern durch eine Vergrößerung des Stuhlvolumens erfolgt, was zu einer Verdünnung von Stuhl-Karzinogenen und einer verringerten Transmissionszeit und somit zu einer rascheren Karzinogen-Elimination führt. Diese Ergebnisse lassen auf die Möglichkeit schließen, dass dann, wenn eine Verringerung der Konzentration der Stuhl-Karzinogenbelastung zu einem verminderten Krebsrisiko führt, eine Zunahme der Karzinogen-Belastung zu einem erhöhten Risiko führen kann. Eine derartige Zunahme von Kolon-Karzinogenen könnte aus aufeinanderfolgenden entzündlichen Ereignissen abgeleitet werden.
Ein besonders relevantes Beispiel ist die entzündliche neutrophile Bildung von karzinogenen Nitrosaminen über die L-Arginin-abhängige Bildung von Stickoxiden, wie Stickstoffmonoxid (Grisham, Gastroenterology, Bd. 104 (1993), S. A243). Zu weiteren oxidativen Produkten, die durch entzündliche Zellen freigesetzt werden, gehören Superoxid sowie Wasserstoffperoxid, die in Gegenwart bestimmter Übergangsmetalle, wie Eisen (Fe), das hochgradig reaktive und zytotoxische Hydroxylradikal (OH:) erzeugen können (Grisham, Biochem. Pharmacol., Bd. 39 (1990), S. 2060–2063). Zusätzlich zur erhöhten Belastung mit Karzinogenen und freien Radikalen, die durch den Zustrom von entzündlichen Zellen erfolgt, ist es auch bekannt, dass die Arachidonsäure-Kaskade zur Erzeugung von mutagenen Metaboliten befähigt ist. Ein Metabolit von Prostaglandin H2 (PGH2), Malondialdehyd (MDA), stellt ein direkt wirkendes in vitro-Mutagen (Mukai und Goldstein, Science, Bd. 191 (1976), 5. 868–869) und ein Karzinogen bei Tieren dar (Basu und Marnett, Carcinogenesis, Bd. 4 (1983), S. 331–333) und kann enzymatisch durch Thromboxan-synthetase in hohen Ausbeuten in Zellen mit einem aktiven Cyclooxygenase-Stoffwechselweg erzeugt werden. Es wurde gezeigt, dass MDA Frameshift-Mutationen erzeugt, ähnlich solchen, die mit dem humanen Kolon p53-Gen assoziiert sind (Marnett, et al., Mutat. Res., Bd. 129 (1985), S. 36–46). PGH-synthase selbst ist eine starke Peroxidase, von der gezeigt wurde, dass sie die Aktivierung einer Vielzahl von polycyclischen Kohlenwasserstoffen zu Mutagenen katalysiert (Marnett, Life Sci., Bd. 29 (1981), S. 531–546).
Diese Befunde lassen darauf schließen, dass eine chronische und anomale (durch entzündliche Zellen veranlasste) Aktivierung der Arachidonsäure-Kaskade im gastrointestinalen Trakt einen Weg darstellt, der zu einer erhöhten Karzinogen-Belastung unter potentieller Induktion von DNA-Mutationen während Zeiten einer maximalen DNA-Synthese führen kann. Eine erhöhte Zellproliferation, die einer durch eindringende entzündliche Zellen induzierten epithelialen Entblößung folgt, kann zu einer erhöhten Anzahl an Zellen, die gegenüber der Einwirkung von derartigen Karzinogenen empfindlich sind, führen. Alternativ kann eine erhöhte Proliferation dazu führen, dass vorher durch Karzinogene induzierte Mutationen (über eine klonale Expansion) amplifiziert werden.
Eine veränderte Eicosanoid-Regulierung kann aufgrund von entzündlichen Episoden eine Proliferation antreiben. Ein weiterer Mechanismus, der eine GI-Entzündung und die Progression von GI-Karzinomen verbindet, könnte in einer Unterbrechung der normalen Eicosanoid-Regulierung liegen. Wie vorstehend erörtert, sind die normalen differenzierten Funktionen des mukosalen IG-Epithels eng mit dem breiten Bereich von biologischen Aktivitäten, die durch endogene Eicosanoide beeinflusst werden, verknüpft. Da diese Mittel lokal wirken und aufgrund einer aktiven metabolischen Inaktivierung im allgemeinen eine kurze Halbwertszeit aufweisen, verändern Perioden von akuten entzündlichen Ereignissen in drastischer Weise die normale Regulierung der Eicosanoid-Homeostase.
Beim Eindringen von Neutrophilen und Makrophagen in den Ort einer Entzündung wird diese normale Dynamik drastisch verändert. Erstens bringen entzündliche Zellen vielfältige weitere Agonisten mit sich, wie Cytokine, Proteasen und Wachstumsfaktoren (Adams und Hamilton, Ann. Rev. Immunol., Bd. 2 (1984), S. 283–318; Ohlsson et al. Physiol. Chem., Bd. 358 (1977), S. 361–366, Nathan und Cohn, in: Kelly et al. (Hrsg.), Textbook of Rheumatology, New York (1980), W. B. Saunders, S. 186–215), die ihrerseits chronisch zelluläre PLA2 (cPLA2) unter Freisetzung von Arachidonsäure aktivieren. Zweitens stellen entzündliche Zellen eine reiche Quelle zusätzlicher Formen von PLA2 dar, die als sekretorische oder sPLA2 bekannt sind (Seilhamer et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 5335–5338), deren Aktivitäten bei entzündlichen GI-Krankheiten kürzlich dokumentiert wurden (Minami et al., Gut, Bd. 33 (1992), S. 914–921).
Im Gegensatz zu cPLA2 wird sPLA2 aus entzündlichen Zellen (Wright et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 6675–6681), Blutplättchen (Hayakawa et al., J. Biochem., Bd. 104 (1988), S. 767–772), Chondrozyten (Lyons-Giordano et al., Biochem. Biopys. Res. Commun., Bd. 164 (1989), S. 488–495) und glatten Muskelzellen (Nakano et al., FEBS Lett., Bd. 261 (1990), S. 171–174) durch Cytokine (Pfeilschifter et al., Biophys. Res. Commun., Bd. 159 (1989), S. 385–394) und insbesondere durch Endotoxin (Oka und Arita, J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 9956–9960) freigesetzt. Da ferner das extrazelluläre Milieu maximale Calciumkonzentrationen aufweist, ist sPLA2 unreguliert, nachdem es freigesetzt worden ist. Bei der Freisetzung hydrolysiert es daher in aktiver Weise Arachidonsäure und andere Fettsäuren aus der sn-2-Position von Phospholipiden, die in zellulären und bakteriellen Membranen auftreten, sowie Fettsäuren aus diätetischen und Lipoprotein-Quellen. Das Lysophospholipid, das sich durch Entfernung der sn-2-Fettsäure aus zahlreichen derartigen Phospholipiden ergibt, wirkt stark lysogen auf umgebende Zellen (Okada und Cyong, Jpn. J. Exp. Med., Bd. 45 (1975), S. 533–534). Somit kann diese Umsetzung zu einer epithelialen Zelllysis und Entblößung im unfiltrierten Bereich führen, was letztlich eine verstärkte Proliferation erforderlich macht, um die Sperrfunktion aufrechtzuerhalten.
Entzündliche Reaktion und Aktivierung von Genen, die die zelluläre Invasion dirigieren. Die entzündliche Reaktion unterbricht nicht nur die normale Eicosanoid-Regulierung, sondern führt auch zur Aktivierung von Genprodukten, die für die zelluläre Invasion erforderlich sind. Ein derartiges Produkt, der Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (uPAR), wird normalerweise durch intestinale Epithelzellen exprimiert. Seine Verankerung an der Zelloberfläche kann eine wichtige Determinante der normalen Kryptzellenwanderung und -abschuppung über eine Zelloberflächenproteolyse darstellen (Kristensen et al., J. Cell. Biol., Bd. 115 (1991), S. 1763–1771). Bei entzündlichen Zellen wird die uPAR-Genexpression durch Aktivatoren von Protein-kinase C, durch Tumor-Promotoren, wie den Phorbolester TPA (Lund et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 5177–5181) und durch verschiedene Cytokine (Lund et al., EMBO J., Bd. 10 (1991), S. 3399–3401) induziert, die einen invasiven Phänotyp induzieren, der für die Gewebeinfiltration erforderlich ist (Stoppelli et al., Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 4939–4943). Es ist daher nicht überraschend, dass hohe Niveaus der uPAR-Expression auch in verschiedenen Tumor-Zelllinien mit metastatischem Potential nachgewiesen wurden, einschließlich in von Kolon-Karzinom abgeleiteten Zellen (Pyke et al., Am. J. Pathol., Bd. 138 (1991), S. 1059–1067). Von besonderem Interesse sind gemeinsame Kulturexperimente, die zeigen, dass das invasive Potential stärker mit einer Expression von uPAR als mit dessen Ligand Plasminogenaktivator korrelierte (Ossowski et al., J. Cell. Biol., Bd. 115 (1991), S. 1107–1112). Somit könnten mehrfache Zyklen von entzündlichen Reaktionen auch zu einer uPAR-Überexpression in Kolon-Schleimhautzellen beitragen, was dazu führt, dass ein vorher gutartiger Tumor einen invasiven Phänotyp annimmt.
GI-Schleimhautzellen können daher in besonderer Weise aufgrund von 3 sich gegenseitig schneidenden Wegen gegenüber chronischen entzündlichen Episoden empfindlich sein: (1) die Epithelzellen befinden sich in einer Umgebung mit einer hohen Karzinogenbelastung, die während entzündlicher Episoden noch weiter zunehmen kann; (2) die Produkte sowohl der endogenen als auch der infiltrierten Eicosanoid-Kaskaden stellen trophische Mittel dar; und (3) ihre eigene differenzierte Reaktion auf entzündliche Mittel umfasst eine Expression von Genprodukten, die für die Annahme eines invasiven Phänotyps erforderlich sind. Zusammen können diese drei Wege auch zu einem Transformationsereignis und zu einer sich daraus ergebenden Tumor-Induktion, -Progression und -Invasion führen. Daher sind Mittel, die bestimmte Arme der Eicosanoid-Kaskade blockieren, bei der Chemoprävention von Kolon-Karzinom wertvoll.
Polypen und aberrante kryptische Foci (Aberrant Crypt Foci) als Vorläufer von Kolon-Karzinom. Derzeit wird weitgehend die Auffassung vertreten, dass adenomatöse Polypen Vorläufer von kolorektalem Krebs sind und ihr Erscheinungsbild, ihre Größe und ihre Anzahl Vorhersagen über das relative Risiko der Entwicklung eines Kolon-Karzinoms zulassen (vergl. Lotfi et al., Mayo Clinic Proc., Bd. 61 (1986), S. 337–343). Während adenomatöse Polypen Vorläuferläsionen von Kolon-Karzinom sind, wird nunmehr auch angenommen, dass bestimmte frühe pathologische Läsionen, die als aberrante kryptische Foci bezeichnet werden, Vorläuferläsionen von adenomatösen Polypen sind. Aberrante kryptische Foci (ACF) sind in der normal erscheinenden humanen Kolon-Schleimhaut identifizierbar, und es wurde gezeigt, dass sie zahlreicher und größer in Proben von Patienten mit sporadischem Kolon-Karzinom oder gattungsmäßig vererbter familiärer adenomatöser Polypose auftreten (Ronucucci et al., Human Pathol., Bd. 22 (3) (1991), S. 287–294; Pretlow et al., Cancer Res., Bd. 51 (1991), S. 1564–1567).
NSAIDs und Kolon-Karzinom-Chemoprävention. Es gibt Anzeichen, dass verschiedene nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs) eine Verringerung der Anzahl von Tieren mit Tumoren und des Auftretens von Tumoren pro Tier in Rattenmodellen der Kolon-Karzinogenese bewirken (Narisawa et al., Cancer Res., Bd. 41 (1981), S. 1954–1957); (Pollard et al., Cancer Lett., Bd. 21 (1983), S. 57–61); (Moorghen et al., J. Pathol., Bd. 156 (1988), S. 341–347); (Reddy et al., Gastroenterology, Bd. 104 (1993), S. A443). Es wurde eine bis zu 70%ige Verringerung des Auftretens von Tumoren bei Dosen, die 80% der maximal tolerierten Dosis betrugen, festgestellt. In einer Studie über die durch Dimethylhydrazin induzierte Kolon-Karzinogenese wurde festgestellt, dass Sulindac das Auftreten von Tumor nur dann verringert, wenn es während der Verabreichung des Karzinogens vorhanden ist, jedoch nicht, wenn es 17 Wochen im Anschluss an die Verabreichung des Karzinogens gegeben wird (Moorghen et al., J. Pathol., Bd. 156 (1988), S. 341–347).
In verschiedenen retrospektiven Studien wurde die Einnahme von Aspirin als eine chemopräventive Therapie für das anschließende Auftreten von Kolon-Karzinom beurteilt. Die Ergebnisse dieser Studien reichten von einer Halbierung (Kune et al., Cancer Res., Bd. 48 (1988), S. 4399–4404) des Risikos der Entwicklung von Kolon-Karzinom bis zu einem um 50% erhöhten Risiko (Paganini-Hill et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. 83 (1991), S. 1182–1183). Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass alle Humanstudien, bei denen Aspirin und andere NSAIDs eingesetzt werden, insbesondere retrospektive Studien, durch die herbeigeführte Häufigkeit von gastrointestinalen Blutungen verfälscht werden können, die einen früheren Nachweis des Polypen oder des Tumors in der NSAID-Gruppe durch Screening auf okkultes Blut und Sigmoidoskopie ermöglichen.
Obgleich die retrospektiven Aspirin-Studien zu zweideutigen Ergebnissen geführt haben, wurden die anfänglichen Ergebnisse für bestimmte NSAIDs aus Tierstudien, die vorstehend zusammengefasst wurden, in prospektiven Humanversuchen wiederholt. Vom NSAID Sulindac wurde in einer randomisierten, mit Placebo kontrollierten Doppelblind-Überkreuzstudie gezeigt, dass es in weniger als 4 Monaten bei 9 Patienten mit familiärer Polypose eine Regression von Polypen verursacht hat (Labayle et al., Gastroenterology, Bd. 101 (1991), S. 635–639). Ferner nahmen nach Absetzen von Sulindac die Polypen ihr Wachstum wieder auf. Dieser Befund ist von Bedeutung, da bei einer ähnlichen Studie unter Verwendung von Indomethacin kein Einfluss auf eine Polypen-Regression festgestellt wurde (Klein et al., Cancer, Bd. 60 (1987), S. 2863–2868). Obgleich bei diesen beiden NSAIDs die entzündungshemmende Aktivität sich von einer Hemmung von Cyclooxygenase ableitet, handelt es sich bei Sulindac um eine Arzneistoffvorstufe, die durch Kolon-Bakterien in den aktiven Metaboliten, nämlich Sulindac-sulfid, umgewandelt wird (Shen und Winter, Adv. Drug. Res., Bd. 12 (1975), S. 89–245). Im Gegensatz dazu wird Indomethacin in seiner aktiven Form aufgenommen, wobei vorwiegend im oberen gastrointestinalen Trakt für eine systemische Abgabe resorbiert wird (Hucker et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Bd. 153 (1966), S. 237–249). Es ist daher wahrscheinlich, dass die Konzentrationen des durch Sulindac an das Kolon abgegebenen aktiven Metaboliten deutlich höher als die von Indomethacin sind. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass ein erheblicher Teil der beobachteten chemopräventiven Wirkung von NSAID sich von einer lokalen Wirkung des Arzneistoffes auf die Schleimhaut-Lumen-Grenzfläche ableitet.
Obgleich dieser Hinweis auf eine NSAID-induzierte Hemmung des Auftretens eines Kolon-Tumors in Tiermodellen auf einen Hemmmechanismus über Tumorzell-Cyclooxygenase schließen lässt, fehlt eine Bestätigung für einen derartigen Mechanismus. Es wurde gezeigt, dass Tumorgewebe, das aus mit NSAID behandelten Tieren herausgeschnitten worden war, drastisch verringerte Konzentrationen an PGE2 sezerniert, was mit dieser Hypothese übereinstimmt (Reddy et al., Carcinogenesis, Bd. 13 (1992), S. 1019–1023). Jedoch sind die meisten Kolon-Tumoren bezüglich ihrer residenten Zelltypen heterogen, und mehrere Berichte dokumentieren, dass epitheliale Zelllinien, die aus kolorektalen Adenokarzinomen erzeugt worden sind, keine starken Bildner von PGE2 oder anderen Prostanoiden darstellen (Hubbard et al., Cancer Res., Bd. 48 (1988), S. 4770–4775). Ein Bericht über die Eicosanoid-Bildung von Zellen, die aus humanem Kolon-Gewebe fraktioniert worden waren, zeigte jedoch, dass Tumor-Epithelzellen ähnliche PGE2-Spiegel wie unbeteiligtes Gewebe erzeugten, während aus Tumoren stammende mononukleare Zellen eine erheblich größere Eicosanoid-Synthese als ihre normalen Gegenstücke zeigten (Maxwell et al., Digestion, Bd. 47 (1990), S. 160–166). Daher handelt es sich bei Zielzellen, die gegenüber einer NSAID-Hemmung empfindlich sind, möglicherweise nicht um epitheliale Tumorzellen, sondern es kann sich um irgendwelche andere resistente Zellen handeln, die hohe PG-Spiegel erzeugen, auf die die Epithelzellen reagieren.
Profil der bevorzugten chemopräventiven Therapie. Sämtliche NSAIDs sind mit erheblichen Nebenwirkungsprofilen behaftet. NSAIDs sind in ihrer Hemmung von Cyclooxygenase-Produkten nicht gewebespezifisch und sowohl renale als auch gastrointestinale Systeme sind besonders empfindlich. NSAIDs verringern die renale Perfusion, woraus sich eine Nephrotoxizität ergibt (Clive und Stoff, N. Engl. J. Med., Bd. 310 (1984), S. 563–572), und da Prostaglandine für die normalen differenzierten Funktionen des gastrointestinalen Epithels notwendig sind, stellt eine durch NSAID induzierte gastrische Ulzeration einen erheblichen Beitrag zur Morbidität und Mortalität, die mit dieser Klasse von Arzneistoffen verbunden ist, bereit (Langman, Gastroenterology, Bd. 96 (1989), S. 640–646; Bjarnason et al. Gastroenterology, Bd. 104 (1992), S. 1832–1847). Es wurde berichtet, dass eine chronische NSAID-Therapie im unteren Darm zu Kolitis führt, die von Proktitis zu Pankolitis reicht (Tanner und Raghunat, Digestion, Bd. 41 (1988), S. 116–120). In einer retrospektiven Studie wurde eine Abschätzung vorgenommen, dass bei 25% der Patienten, die eine Perforation des Dickdarms und des Dünndarms und Blutungen aufwiesen, eine Einnahme von NSAID vorgelegen hatte (Langman et al., Br. Med. J., Bd. 290 (1985), S. 347–349). Schließlich ist bei Patienten mit vorhandenen chronischen entzündlichen Darmerkrankungen, bei denen bereits ein hohes Risiko der Entwicklung von kolorektalem Krebs besteht, eine Therapie mit Nicht-5-ASA enthaltenden NSAIDs sowie mit Aspirin kontraindiziert, was auf eine Verschlimmerung des existierenden Krankheitszustands zurückzuführen ist (Rampton und Sladen, Prostaglandins, Bd. 21 (1981), S. 417–425). Ein idealer Arzneistoff für die Chemoprävention von Kolon-Karzinom weist somit das folgende Profil auf:

1) Kolon-Spezifität: Es soll sich um eine Arzneistoffvorstufe handeln, die keine Aktivität im oberen gastrointestinalen Trakt entwickelt, die aber beim Erreichen des Kolons in eine aktive Form umgewandelt wird (Sulindac-artig);
2) begrenzte Resorption: Die Resorption des Ausgangsstoffes und der Metaboliten soll minimal sein, insbesondere nachdem er in seine aktive Form umgewandelt worden ist;
3) Fehlen von systemischer Aktivität: Nach der Resorption soll eine Stoffwechselinaktivierung den Arzneistoff in eine inaktive Form überführen, wodurch systemische Effekte auf Nieren- und Magendarmsysteme begrenzt werden;
4) antioxidative Eigenschaften: Eine Kolon-spezifische Antioxidationsaktivität würde ferner dazu dienen, die Karzinogen-Belastung zu senken; und
5) NSAID-artiger entzündungshemmender Mechanismus: Der aktive Metabolit soll durch Entzündungen induzierte Eicosanoid-Stoffwechselwege hemmen, wobei jedoch eine Eicosanoid-Hemmung ohne Beeinträchtigung der Aufrechterhaltung von grundlegenden Stoffwechselwegen zu bevorzugen wäre.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass von bestimmten NSAIDs gezeigt worden ist, dass sie das Auftreten von Kolon-Tumoren in karzinogen-induzierten Tiermodellen hemmen und das Polypenwachstum bei Menschen hemmen. Obgleich der Mechanismus für die Tumorhemmung durch NSAIDs nicht nachgewiesen ist, modulieren diese Arzneistoffe möglicherweise die gastrointestinale Eicosanoid-Erzeugung und -Stoffwechsel. Ungünstigerweise haben NSAIDs auch ein störendes und schwerwiegendes gastrointestinales Nebenwirkungsprofil, das möglicherweise ihre chronische Verwendung ausschließt. Daher wäre es in hohem Maße erstrebenswert, NSAIDs zu identifizieren, die als chemopräventive Mittel wirksam sind, bei denen diese Nebenwirkungen aber fehlen. Chan beschreibt im US-Patent 4 412 992 die Herstellung von 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivaten und ihre Verwendung bei der Behandlung von ulzerativer Kolitis.
Offenbarung der Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats der allgemeinen Formel
bereitgestellt, wobei
X eine -SO₂- oder -CO-Gruppe darstellt;
R entweder eine Phenyl- oder Carboxymethylphenylgruppe oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_n-Y darstellt, bei welcher Y eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Mono-(C_1-6)-alkyl- oder Di-(C_1-6)-alkylaminogruppe, eine Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und bei welcher eines oder mehrere der Wasserstoffatome in der Alkylengruppe durch Aminogruppen, Mono-(C_1-6)-alkyl- oder Di-(C_1-6)-alkylaminogruppen oder Alkylgruppen ersetzt sein können;
die -(CH₂)_n-Y-Gruppe entweder direkt an das Stickstoffatom oder über einen Benzolring gebunden ist, mit der Maßgabe, dass R-NH-X- eine andere als eine CO-NHCH-CH₂-COOH-Gruppe ist;
oder eines Esters davon;
oder eines nicht-toxischen, pharmakologisch verträglichen Salzes einer der vorhergehenden Verbindungen;
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, welches an Darmkrebs (Kolon-Karzinom) leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Darmkrebs aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Medikament im wesentlichen aus dem 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivat oder einem Ester davon oder einem Salz des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder einem Ester davon in Mischung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Träger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich beim 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivat um Balsalazid.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Medikament oral einem Individuum, welches an Darmkrebs leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Darmkrebs aufweist, in einer täglichen Dosis im Bereich von 1 bis 14 g pro 70 kg Körpergewicht pro Tag des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder eines Esters davon oder eines Salzes des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder eines Esters davon verabreicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Medikament rektal einem Individuum welches an Darmkrebs leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Darmkrebs aufweist, in einer täglichen Dosis im Bereich von 1 bis 14 g pro 70 kg Körpergewicht pro Tag des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder eines Esters davon oder eines Salzes des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder eines Esters davon verabreicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die chemische Struktur eines 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats, dessen Freinahme Balsalazid ist. Der Aminosalicylatrest 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) ist mit einem Trägermolekül, nämlich 4-Aminobenzoyl-β-alanin (4-ABA), über eine Azobindung verknüpft.
2 zeigt die Einflüsse von 5-ASA auf die Proliferation der Adenokarzinom-Zelllinie HT-29 in Dosen von 0, 0,1, 1,0 und 10 mM. Die angegebenen Zellzahlen stellen den Mittelwert von Dreifachversuchen dar.
3 zeigt die Einflüsse von 5-ASA auf die Proliferation der Adenokarzinom-Zelllinie LS174T in Dosen von 0, 0,1, 1,0 und 10 mM. Die angegebenen Zellzahlen stellen den Mittelwert von Dreifachversuchen dar.
4 zeigt eine Analyse der Anzahl der aberranten Kolon-Krypten, die durch Behandlung von Gruppen von Ratten mit dem Karzinogen Azoxymethan in Gegenwart und Abwesenheit von Balsalazid bei Verabreichung im Trinkwasser induziert werden.
5 zeigt die relativen Hemmreaktionen, die durch Balsalazid und 5-A5A in niedrigeren Konzentrationen hervorgerufen werden.
6A und 6B zeigen die Verteilung der aberranten kryptischen Foci im gesamten Kolon von Kontrolltieren und von Tieren, die eine Injektion von AOM (20 mg/kg) erhalten haben, und zwar 6 Wochen nach der zweiten Injektion. Die Anzahl der Foci mit einem Gehalt an 1, 2, 3, 4 oder 5 oder mehr Krypten ist angegeben (untere bis obere Kurven in jeder Abbildung).
Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivate und insbesondere Balsalazid bei der Chemoprävention von Kolon-Karzinom wirksam sind. Diese 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivate weisen die folgende allgemeine Formel auf
wobei X eine -SO₂- oder -CO-Gruppe darstellt; und R entweder eine Phenyl- oder Carboxymethylphenylgruppe oder eine Gruppe der Formel -(CH₂)_n-Y darstellt, bei welcher Y eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Monoalkyl- oder Dialkylaminogruppe, wobei die Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatomen enthalten, oder eine Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe darstellt, und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und bei welcher eines oder mehrere der Wasserstoffatome in der Alkylengruppe durch Aminogruppen, Monoalkyl- oder Dialkylaminogruppen, wobei die Alkylreste bis zu 6 Kohlenstoffatome enthalten, oder Alkylreste ersetzt sein können; und bei welchen die -(CH₂)_n-Y-Gruppe entweder direkt an das Stickstoffatom oder über einen Benzolring gebunden ist, mit der Maßgabe, dass R-NH-X- eine andere als eine -CO-NHCH-CH₂-COOH-Gruppe ist.
Der hier verwendete Ausdruck "2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivat" umfasst auch Ester oder aktive Metaboliten der Verbindung oder nicht-toxische, pharmakologisch verträgliche Salze der Verbindung oder deren Ester oder aktive Metaboliten.
Der Ausdruck "aktiver Metabolit" bezieht sich auf Produkte des Stoffwechsels von 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivaten im menschlichen Körper, z. B. über die Wirkung von Kolon-Bakterien, die die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen hemmen. Beispielsweise stellt, wie nachstehend erörtert, 5-ASA einen aktiven Metaboliten von Balsalazid dar.
Der Ausdruck "Oxidationsprodukt" bezieht sich auf Produkte, die erzeugt werden, indem man aktive Metaboliten von 2-Hydroxy-5- phenylazobenzoesäure-Derivaten, beispielsweise 5-ASA, oxidierenden Bedingungen, wie Hypochlorit oder Wasserstoffperoxid, aussetzt.
Balsalazid-natrium ist ein kolonspezifisches, nicht-steroidales, entzündungshemmendes Aminosalicylat, das sich bei der Behandlung von aktiver ulzerativer Kolitis eignet. Balsalazid sowie eines seiner primären Metaboliten hemmt das Wachstum von gezüchteten humanen Kolon-Karzinomzellen und Balsalazid hemmt die aberrante Kryptenbildung in Tieren, die mit dem Karzinogen Azoxymethan behandelt worden sind. Wie andere NSAIDs ist Balsalazid bei der Chemoprävention von humanem kolorektalen Krebs wirksam. Jedoch weist Balsalazid drei wichtige Sicherheitsvorteile auf: (1) die Abgabe des Arzneistoffes ist kolonspezifisch; (2) es wurden keine Anzeichen einer gastrischen oder duodenalen Ulzeration beobachtet; und (3) bei über 500 Patienten, die bisher behandelt wurden, wurde über keine Anzeichen von Nephrotoxizität berichtet, wobei einige Patienten über einen langen Zeitraum von 3 Jahren behandelt worden sind. Balsalazid besitzt daher eine ideale Kombination von Wirksamkeit und Sicherheit für die Chemoprävention von Kolon-Karzinom.
Kolonspezifische Abgabe. Balsalazid ist eine Arzneistoffvorstufe, deren inaktive Form, wie Sulindac, durch die Wirkung von Kolon-Bakterien in einen aktiven entzündungshemmenden Arzneistoff umgewandelt wird. Wie in 1 dargestellt, verknüpft Balsalazid das Aminosalicylat 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) mit einem inerten Trägermolekül, nämlich 4-Aminobenzoyl-β-alanin (4-ABA), über eine Azobindung. Eine bakterielle Azoreduktase hydrolysiert diese Bindung und setzt das 5-ASA für eine lokale Wirkung frei.
Begrenzte systemische Resorption. Bei oraler Einnahme passiert Balsalazid in ungespaltener Form und praktisch ohne Resorption den oberen gastrointestinalen Trakt. Nur 0,3% der eingenommenen Dosis der Arzneistoffe finden sich in Plasma oder Urin, wobei 99% des Arzneistoffes in intakter Form das Kolon erreichen. Im Kolon unterliegt der Arzneistoff einer Hydrolyse unter Bildung von 5-ASA und 4-ABA, die in Wechselwirkung mit der Kolon-Schleimhaut treten und in ihre N-Acetylformen umgewandelt werden. Der Großteil des 5-ASA, das aus einer einzelnen Dosis von Balsalazid entsteht, wird innerhalb einer Zeitspanne von 96 Stunden in N-Acetyl-5-ASA (Nac5ASA) umgewandelt und im Urin ausgeschieden, während das 4-ABA und dessen N-Acetylmetabolit nur schlecht resorbiert werden. Da der N-Acetylmetabolit von 5-ASA inaktiv ist, wird die systemische Aktivität von abgegebenem 5-ASA ebenfalls verringert (Chan et al., Dig. Dis. Sci., Bd. 28 (1983), S. 609–615).
Antioxidative Eigenschaften. Wie vorstehend erörtert, kann ein chemopräventives Mittel, das wirksame antioxidative Eigenschaften besitzt, auch zu einer Verringerung der Karzinogen-Belastung des Kolons sowie zu einer Verringerung der durch die Freisetzung von freien Radikalen aus eindringenden entzündlichen Zellen herbeigeführten Schädigung beitragen. 5-ASA hemmt die Nitrosamin-Bildung von Argininabhängigem Stickoxid (Grisham, Gastroenterology, Bd. 104 (1993), S. A243). Ferner stellen sowohl intaktes Balsalazid als auch 5-ASA wirksame Fänger von freien Radikalen gegenüber o₂ ^– und OH: dar. Balsalazid und 5-ASA verringern bei Inkubation mit rektalen Biopsieproben von Patienten mit ulzerativer Kolitis die Erzeugung von rektalen, mukosalen, reaktiven Sauerstoffmetaboliten um über 90%. Beide Mittel sind auch wirksamer als die Antioxidationsmittel Taurin, Ascorbat oder N-Acetylcystein bei Verwendung in ähnlichen Konzentrationen (Simmonds et al., Gastroenterology, Bd. 102 (1992), S. A696).
Entzündungshemmende Kolon-Aktivität ohne Einfluss auf den oberen gastrointestinalen Trakt. Balsalazid besitzt in mehreren Tiermodellen der Kolon-Entzündung eine entzündungshemmende Aktivität sowie bei Patienten mit aktiver (Green et al., Gastroenterology, Bd. 104 (1993), S. A709) als auch bei ruhender ulzerativer Kolitis (Gaiffer et al., Ailment Pharmacol. Ther., Bd. 6 (1992), S. 479–485) . Von Bedeutung ist, dass der Arzneistoff eine hervorragende gastrointestinale Verträglichkeit zeigt.
Balsalazid und 5-ASA hemmen in vitro die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen. 5-ASA zeigt ebenso wie Balsalazid eine signifikante Wachstumshemmwirkung gegenüber humanen Kolon-Karzinomzellen.
Oxidationsprodukte von 5-ASA hemmen in vitro die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen. Oxidationsprodukte von 5-ASA zeigen in überraschender Weise eine unerwartete Wachstumshemmwirkung gegenüber humanen Kolon-Karzinomzellen im Vergleich zu 5-ASA.
Verfahren zur Chemoprävention und/oder Chemotherapie von Kolon-Karzinom
2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivate der Erfindung und insbesondere Balsalazid und dessen Metaboliten eignen sich daher zur Chemotherapie von Kolon-Karzinom. Sie werden vorzugsweise Menschen , die an Kolon-Karzinom leiden oder ein Risiko zur Entwicklung von Kolon-Karzinom aufweisen, in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivate umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch einen oder mehrere nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Exzipientien und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Eine orale Verabreichung wird bevorzugt. Übliche pharmazeutische Zubereitungstechniken werden herangezogen, wie sie beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., letzte Auflage, beschrieben sind.
Die Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granalien, Pastillen, Flüssigkeiten oder Gelpräparaten vorliegen. Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in einer Form, die sich für die Darreichung als Dosiseinheit eignet, vorliegen und können herkömmliche Exzipientien enthalten. Zu Beispielen hierfür gehören: Bindemittel, wie Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Traganth und Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Tablettiergleitmittel, wie Magnesiumstearat, Siliciumdioxid, Talcum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid; Sprengmittel, wie Kartoffelstärke; oder verträgliche Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können nach Verfahren, die in der üblichen pharmazeutischen Praxis bekannt sind, beschichtet werden. Orale flüssige Präparate können beispielsweise in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren vorliegen oder sie können in Form eines trockenen Produkts dargereicht werden, das vor der Verwendung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger rekonstituiert wird. Derartige flüssige Präparate können herkömmliche Additive enthalten, z. B. Suspendiermittel, wie Sorbit, Sirup, Methylcellulose, Glucosesirup, Gelatine, hydrierte Speisefette, Emulgiermittel, wie Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nicht-wässrige Träger (einschließlich Speiseöle), wie Mandelöl, fraktioniertes Kokosöl, ölige Ester, z. B. von Glycerin, Propylenglykol oder Ethylalkohol; Konservierungsmittel, wie Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure, und gegebenenfalls herkömmliche Aromastoffe oder farbgebende Mittel.
Der prozentuale Anteil des aktiven Materials in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann variieren, wobei es erforderlich ist, dass er in einem solchen Anteil enthalten ist, dass eine geeignete Dosis für die angestrebte therapeutische Wirkung erreicht wird. Im allgemeinen sollen die erfindungsgemäßen Präparate oral oder rektal an Menschen so verabreicht werden, dass sich 1 bis 14 g aktive Substanz pro Tag pro 70 kg Körpergewicht ergeben.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung und stellen in keiner Weise eine Beschränkung dar.
Beispiele
Beispiel 1: Balsalazid und 5-ASA hemmen in vitro die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen
Die Aktivität von Balsalazid und dessen Metabolit 5-ASA in Bezug auf das Wachstum von humanen Kolon-Karzinomzellen wurde in vitro unter Verwendung der humanen Adenomazellen HT-29 und LS174T nachgewiesen. Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium, das mit 10% Kälberserum ergänzt war, in einer Atmosphäre mit einem Gehalt an 5% Co₂ bei 37°C gezüchtet. Für die Züchtungsexperimente wurden die Zellen in Gewebekulturschalen mit 24 Vertiefungen (2 cm²/Vertiefung) in einer Dichte von 20 000 Zellen/Vertiefung überimpft und 12 Stunden zum Anhaften gebracht. Das Wachstumsmedium wurde sodann ausgetauscht und durch frisches Medium mit einem Gehalt an den zu testenden Arzneistoffen ersetzt.
Die Testarzneistoffe wurden in Gewebekulturmedium in der erwünschten Konzentration gelöst und in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Um die Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu bestimmen, wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Sodann wurden die Zellen 15 Minuten mit Trypsin-EDTA-Lösung inkubiert, bis sie sich ablösten. Die abgelösten Zellen wurden sodann aus den Vertiefungen entfernt und unter Verwendung eines Coulter Counter-Geräts (Modell ZBI) gezählt. Wie in den 2 und 3 dargestellt ist, unterlagen die beiden humanen Kolon-Karzinomzelllinien HT-29 und LS174T einer Wachstumshemmung durch zunehmend höhere Konzentrationen an 5-ASA. Bei einer Dosis von 10 mM 5-ASA erreichte die Hemmung einen Wert von 82 bzw. von 85%.
Vergleichsstudien wurden ferner durchgeführt, um die Wirksamkeit von Balsalazid und ihren beiden Metaboliten 5-ASA und 4-ABA sowie von Acetylsalicylsäure (Aspirin) auf die Proliferation von Krebszellen zu testen. Wie in Tabelle I dargelegt, zeigte Acetylsalicylsäure, das kovalent Cycloxygenase hemmt, eine starke Hemmwirkung bei diesem Test, was auch für den Ausgangsarzneistoff Balsalazid gilt. Jedoch war 4-ABA, das Trägermolekül von Balsalazid, inaktiv. Die in Tabelle I aufgeführten Zellzahlen stellen Mittelwerte von drei Kulturvertiefungen dar.
Tabelle I
Weitere Studien dienten zur Prüfung der Dosis-Wirkungs-Beziehung der Wachstumshemmwirkung von Balsalazid and 5-ASA. Es zeigte sich, dass beide Verbindungen zu ähnlichen Ergebnissen führten, wenn sie unter Verwendung von HT-29-Zellen oder LS174T-Zellen geprüft wurden. Für Dosis-Reaktions-Studien wurde ein empfindlicher Farbstoffbindungstest adaptiert, der einen gleichzeitigen Test von mehreren Mitteln und Dosen in Platten mit 96 Vertiefungen ermöglicht. Die Zellen wurden ausgestrichen. Vor Zugabe des zu untersuchenden Arzneistoffes ließ man sie 24 Stunden anhaften. Sodann wurden die Zelldichten 4 Tage später durch Fixierung der Vertiefungen und Färbung mit Sulforhodamin B-Farbstoff bestimmt. Die optische Dichte der gefärbten Kulturen wurde anschließend unter Verwendung eines Lesegeräts für Platten mit 96 Vertiefungen bei 495 nm bestimmt (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. 82 (1990), S. 1107–1112).
Wie in 5 gezeigt, rief Balsalazid im Vergleich zu 5-ASA übereinstimmend eine größere Hemmreaktion bei niedrigeren Konzentrationen hervor. Bei Verwendung von HT-29-Zellen betrugen die IC₅₀-Werte 5,7 mM bzw. 11,8 mM, während bei Verwendung von LS174T-Zellen die entsprechenden IC₅₀-Werte 5,2 mM bzw. 11,5 mM betrugen. Bei den niedrigsten getesteten 5-ASA-Konzentrationen (0,1–1,0 mM für LS174T und 0,1–4 mM für HT-29) wurde eine reproduzierbar und statistisch signifikante Zunahme der Zellzahl von etwa 20% bei beiden Zelltypen beobachtet. Dies stimmt mit von anderen Autoren früheren veröffentlichten Ergebnissen überein, die eine Zunahme der Proteinsynthese beobachteten, die durch andere NSAIDs bei niedrigen Konzentrationen induziert wurden, wonach sich bei höheren Konzentrationen eine Hemmung anschloss (Hial et al., J. Pharm. Exp. Therap., Bd. 202 (1977), S. 446–452).
Beispiel 2: Einfluss von Balsalazid und Metaboliten auf die aberrante Kryptenbildung bei der Ratte
Aberrante Krypten wurden ursprünglich bei der Karzinogen-induzierten Kolon-Schleimhaut als Krypten von "erhöhter Größe, dickerer Epithelauskleidung und vergrößerten perikryptalen Zonen" beschrieben (Bird et al., Cancer Surv., Bd. 8 (1989), S. 189–200). NSAIDs gehören zu den stärksten Inhibitoren der aberranten Kryptenbildung, die durch das Karzinogen Azoxymethan (AOM) bei der Ratte induziert wird (Wargovich et al., J. Cell. Biochem., Bd. 16G (1992), S. 51–54). Die Antitumoraktivität von mehreren dieser Mittel wurde in Langzeit-AOM-Tierstudien bestätigt. Das aberrante Kryptenmodell stellt daher einen idealen in vivo-Test zur Ermittlung der Wirksamkeit von Balsalazid und dessen Metaboliten dar.
Hemmung der aberranten Krypteninduktion. Die Wirksamkeit von Balsalazid (BSZ) und dessen Metaboliten 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) und 4-Aminobenzoyl-β-alanin (4-ABA) auf die Hemmung der Bildung von aberranten Krypten wurde in einem Modell des durch Azoxymethan (AOM) induzierten Kolon-Karzinoms bei der Ratte bestimmt.
Vier Gruppen von 5 männlichen F344-Ratten wurden herangezogen. Die Tiere wiesen zu Beginn der Dosierung ein Alter von 6 bis 8 Wochen und ein Ausgangsgewicht im Bereich von +/– 20% des Gesamtmittelwerts auf. Die aus veröffentlichten Studien erwartete Reaktion auf die AOM-Behandlung besteht in der Bildung von 100–140 aberranten Krypten pro Tier (Wargovich et al., J. Cell. Biochem., Bd. 16G (1992), S. 51–54). Unter Verwendung dieser Reaktionsraten und einer chi²-Analyse mit einem Vertrauensbereich von 95% ermöglicht die Probengröße von 5 Tieren pro Gruppe den Nachweis einer statistisch signifikanten Hemmung (auf dem p < 0,05-Niveau) durch die Testarzneistoffe, wenn bis zu 50–75 aberrante Krypten pro Tier festgestellt wurden.
Die Tiere wurden vor der Randomisierung in die Testgruppen entsprechend den Körpergewichtsklassen 10 Tage akklimatisiert. Der Testarzneistoff wurde im Trinkwasser in einer solchen Konzentration gelöst, dass sich die angestrebte Dosis pro Tier pro Tag, bezogen auf eine durchschnittliche Wasseraufnahme von 50 ml pro Tag pro Tier, ergab. Zwei Gruppen erhielten 1 Woche vor den AOM-Injektionen eine Arzneistoffbehandlung. Die Karzinogenese wurde durch zwei subkutane Injektionen von AOM in einer Dosis von 20 mg/kg bei Verabreichung zu Beginn der zweiten Woche und der dritten Woche induziert. Die Dosierung des Testarzneistoffes wurde sodann bis zum Ende der fünften Woche fortgesetzt.
Die Wahl des Dosisniveaus für Balsalazid wird unter Berücksichtigung von anderen präklinischen Studien bezüglich der Wirksamkeit bei Kolitis-Modellen vorgenommen. Eine Dosis von 200 mg/kg/Tag bei einer Ratte von 500 g entspricht einer Dosis von 14 g pro Tag bei einem Menschen mit 70 kg, etwa das 2-fache der therapeutischen Dosis für die Behandlung von aktiver ulzerativer Kolitis und mehr als das 4-fache der Dosis für eine Aufrechterhaltung der Remission. Dieses Dosisniveau führt zu 5-ASA-Kolon-Konzentrationen von 5–20 mM. Die maximale tolerierte Dosis von Balsalazid bei der Ratte liegt über 12 000 mg/kg/Tag.
Das Körpergewicht wurde 2-mal wöchentlich aufgezeichnet. Der Wasserverbrauch in jedem Tierkäfig wurde 2-mal wöchentlich gemessen. Der Verbrauch wird als Mittelwert in ml/Tier/Käfig berechnet.
Für die Analyse von aberranten Krypten wurden die Tiere am Ende der entweder 3-wöchigen oder 5-wöchigen Dosierungsdauer unter CO₂ getötet. Der Dickdarm wurde am Caecum und Anus geschnitten, entnommen und longitudinal geöffnet. Das Gewebe wurde vom Inhalt befreit, in Kochsalzlösung gespült und 2 Stunden bei 4°C in 2% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,2% Methylenblau 3–5 Minuten gefärbt. Nach Spülung mit Kochsalzlösung wurde die Anzahl der Foci von aberranten Krypten durch Zählen unter einem Mikroskop in einer Vergrößerung von 40- bis 100-fach gezählt. Die Länge des Kolongewebes wurde ebenfalls gemessen. Eine repräsentative Probe der grob identifizierten Läsionen wurde in Glykolmethacrylat bei 4°C eingebettet. Schnitte von 3–4 μm der einzelnen Foci werden für eine histologische Bewertung mit Hämatoxylin, Eosin und Azur (HEA) gefärbt.
Für eine gastroduodenale Erosionsanalyse wurden der Fundus, das Antrum und das Duodenum entnommen und getrennt auf die vorstehend angegebene Weise bearbeitet. Gastrische Erosionen wurden unter Anwendung des gastrischen Erosionsindex der Länge und der Schwere gemäß Literaturangaben (Peskar et al., Prostaglandins, Bd. 31 (1986), S. 283–287) bewertet.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, wobei die durchschnittliche Anzahl von aberranten Krypten pro longitudinalem Zentimeter des Kolongewebes für die untersuchten Tiere 1 oder 3 Wochen nach 2 subkutanen Injektionen von Azoxymethan dargestellt ist. Zu beiden Zeitpunkten wiesen die mit Balsalazid behandelten Tiere eine stark verringerte durchschnittliche Anzahl von aberranten Krypten im Vergleich zu den Kontrolltieren auf. Nach 1 Woche ergab sich eine 61,8%ige Hemmung und nach 5 Wochen eine 58,1%ige Hemmung der durchschnittlichen Anzahl von aberranten Krypten.
Hemmung der Progression von aberranten Krypten. Die in 4 dargestellten Daten wurden aus den distalen 7–8 cm des Kolongewebes gewonnen. Zu diesen frühen Zeitpunkten enthielt dieser Bereich mehr als 80% der gesamten aberranten kryptischen Foci. Eine zusätzliche Studie wurde daher konzipiert, um eine längere Zeitspanne zu prüfen, die Verteilung über die gesamten 25 cm des Kolons zu bestimmen und festzustellen, ob die Arzneistoffbehandlung nach der zweiten AOM-Injektion eingeleitet werden kann. Dieses letztgenannte Ziel ist von speziellem Interesse, da der Nachweis wichtig ist, dass das chemopräventive Mittel die Progression des Wachstums von aberranten Krypten im Anschluss an das anfängliche Transformationsereignis durch das Karzinogen hemmt.
Bei der zweiten Studie erhielten Gruppen von 8 Tieren zwei Injektionen von Azoxymethan im Abstand von 1 Woche. Anschließend wurde eine Behandlung mit Balsalazid bei einer Gruppe 24 Stunden im Anschluss an die zweite Injektion eingeleitet. 6 Wochen später wurden die Tiere einer Analyse auf aberrante Krypten unterzogen. Die Krypten wurden in situ durch rektale Instillation einer 0,2%igen Lösung von Methylenblau für 15 Minuten unter Anästhesie gefärbt. Die Tiere wurden sodann entblutet. Kolongewebe wurde aus dem Anus bis zum Caecum geschnitten, gereinigt und 2 Stunden in 2% Paraformaldehyd fixiert. Die Krypten wurden bei Betrachtung in einer Vergrößerung von 40-fach ausgezählt. Zusätzlich zur Gewinnung von Daten über die Anzahl der Foci wurden auch Daten über die Multiplizität von aberranten Krypten pro Foci gewonnen. Diese Daten sind in 6 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass selbst bei Beginn der Gabe von Balsalazid im Anschluss an die zweite AOM-Injektion eine drastische Hemmung von aberranten kryptischen Foci beobachtet wurde, die vergleichbar mit dem in 4 dargestellten früheren Experiment war (eine etwa 60%ige Hemmung insgesamt).
Frühere Studien von Pretlow et al. (Pretlow et al., Carcinogenesis, Bd. 13, (1992), S. 1509–1512) berichteten über die Beziehung zwischen der Multiplizität von aberranten Krypten und der letztendlichen Tumorentwicklung unter Einsatz des gleichen Karzinogenese-Modells. Bei diesen Studien korrelierte die Anzahl der aberranten kryptischen Foci mit einem Gehalt an vier oder mehr aberranten Krypten stark mit der Tumorbildung, was darauf schließen lässt, dass diese größeren Foci eine größere Wahrscheinlichkeit zur Weiterbildung zu Tumoren aufweisen. Die Daten aus dem vorstehenden Experiment wurden analysiert, um den Einfluss von Balsalazid auf die Multiplizität von aberranten Krypten zu bestimmen. Diese Daten sind in der nachstehenden Tabelle II aufgeführt und ergeben, dass Balsalazid eine größere Hemmung auf die Anzahl von Foci mit einem Gehalt an vier oder mehr aberranten Krypten ausübt, als auf solche mit einem Gehalt an weniger als vier Krypten. Für Foci mit 1–3 Krypten betrug die durchschnittliche Hemmung 57–61% (p < 0,003, Fischer-Genauigkeitstest), während die Anzahl von Foci mit vier oder mehr Krypten um durchschnittlich 72–76% (p < 0,001) verringert war. Wenn die Ergebnisse der Anzahl von Foci mit einem Gehalt an vier oder mehr Krypten mit denen mit einem Gehalt an drei oder weniger Krypten verglichen wurde, blieb die Differenz unter Anwendung des Fischer-Genauigkeitstests auf dem p< 0,022-Niveau statistisch signifikant.
Tabelle II
Balsalazid-Hemmung der Multiplizität von aberranten Krypten
Die aufgeführten Zahlenwerte stellen die Mittelwerte der Anzahl von Foci verschiedener Größen in jeder Gruppe von 8 Tieren bei Messung 6 Wochen nach der zweiten AOM-Injektion dar.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Foci, die die größte Anzahl von aberranten Krypten enthalten, mindestens doppelt so stark reduziert werden, wie Foci mit einem Gehalt an 2–3 aberranten Krypten. Bei Interpretation im Zusammenhang mit den Ergebnissen von Pretlow et al. ist es wahrscheinlich, dass diese Hemmung zu einer Hemmung der Tumorbildung führt, wenn die Tiere zu einem späteren Zeitpunkt geprüft werden.
Tabelle III IC₅₀ von Balsalazid für die Hemmung der Proliferation von humanen Kolon-Karzinomzellen. Konzentrationen in mM

Claims

Verwendung eines 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivates der allgemeinen Formel:
wobei X eine -SO₂- oder -CO- Gruppe darstellt; R entweder eine Phenyl- oder Carboxymethylphenylgruppe oder eine Gruppe der Formel (CH₂)_n-Y darstellt, bei welcher Y eine Hydroxygruppe, Aminogruppe, Mono(C_1-6)Alkyl- oder Di(C_1-6)-Alkylaminogruppe, eine Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe darstellt, und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und bei welcher eines oder mehrere der Wasserstoffatome in der Alkylengruppe durch Aminogruppen, Mono(C_1-6)Alkyl- oder Di(C_1-6)Alkylaminogruppen oder Alkylgruppen ersetzt sein können; die -(CH₂)_n-Y-Gruppe entweder direkt an das Stickstoffatom oder über einen Benzolring gebunden ist mit der Maßgabe, daß R-NH-X- eine andere als eine CO-NH-CH₂-COOH Gruppe ist; oder ein Ester davon; oder ein nicht-toxisches, pharmakologisch verträgliches Salz einer der vorhergehenden Verbindungen; zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, welches an Darmkrebs leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Darmkrebs aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament im wesentlichen aus dem 2-Hydroxy-5-phenylazobezoesäure-Derivat oder Ester davon oder einem Salz einer der vorhergehenden Verbindungen in Mischung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünner oder Träger besteht.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivat Balsalazid ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament oral in einer täglichen Dosis im Bereich von 1 bis 14 g pro 70 kg Körpergewicht pro Tag des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivats oder eines Esters davon oder eines Salzes einer der vorhergehenden Verbindungen verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament rektal in einer täglichen Dosis im Bereich von 1 bis 14 g pro 70 kg Körpergewicht pro Tag des 2-Hydroxy-5-phenylazobenzoesäure-Derivates oder Esters davon oder eines Salzes der vorhergehenden Verbindungen verabreicht wird.
Verwendung von Balsalazid zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums, welches an Darmkrebs leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Darmkrebs aufweist.