CN103695515B - 制备板栗蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备板栗蛋白的方法，该方法包括以下步骤：将板栗粉水溶液进行超声波破碎处理；利用纤维素酶对所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液进行第一酶解处理；利用第一α-淀粉酶将第一酶解产物进行第二酶解处理；将第二酶解处理产物进行碱提处理；将碱提产物进行第一离心，并收集上清液，以便获得蛋白质碱提液；利用第二α-淀粉酶将该蛋白质碱提液进行第三酶解处理；利用等电点沉淀法将第三酶解产物进行酸沉；将酸沉产物依次进行静置和第二离心，以便收集获得沉淀；以及将该沉淀进行水洗至中性，以便获得所述板栗蛋白质。利用该方法能够有效提高板栗蛋白提取率，并且由于提取条件温和，所以不会破坏蛋白的活性，制得的板栗蛋白活性好。

Description

制备板栗蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及制备板栗蛋白质的方法。

背景技术

板栗中含蛋白质5%～11%，含量高于稻米，并且赖氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苏氨酸，缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量超过FAO/WHO的标准，而赖氨酸是水稻，小麦，玉米，和大豆类的第一限制性氨基酸，苏氨酸是水稻，小麦的第二限制性氨基酸，色氨酸和蛋氨酸分别是玉米和豆类的第二限制性氨基酸。由此可见，食用板栗或者直接食用板栗蛋白质可以补充禾谷类和豆类中限制氨基酸的不足，可使膳食的营养成分更加完善。

然而，现阶段提取制备板栗蛋白质的方法仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

国内外对板栗蛋白的提取方法主要有两种，一种是传统的碱水法，这种方法的缺点是提取率低。另一种是亚临界水萃取法，这种方法的缺点是提取蛋白的过程容易造成蛋白的变性。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种提取率高、蛋白活性好的制备板栗蛋白的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种制备板栗蛋白的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将板栗粉水溶液进行超声波破碎处理，以便获得经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液；利用纤维素酶对所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液进行第一酶解处理，以便获得第一酶解产物；利用第一α-淀粉酶将所述第一酶解产物进行第二酶解处理，以便获得第二酶解产物；将所述第二酶解处理产物进行碱提处理，以便获得碱提产物；将所述碱提产物进行第一离心，并收集上清液，以便获得蛋白质碱提液；利用第二α-淀粉酶将所述蛋白质碱提液进行第三酶解处理，以便获得第三酶解产物；利用等电点沉淀法将所述第三酶解产物进行酸沉，以便获得酸沉产物；将所述酸沉产物依次进行静置和第二离心，以便收集获得沉淀；以及将所述沉淀进行水洗至中性，以便获得所述板栗蛋白质。发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效提取制备板栗蛋白，并且板栗蛋白提取率高，活性好。具体地，本发明的方法利用超声波和纤维素酶进行酶解作用促进板栗蛋白的溶出，且利用α-淀粉酶酶解破坏蛋白质（在本文中有时也将“蛋白质”简称为“蛋白”）与淀粉的包络作用，从而有效提高了板栗蛋白的提取率，蛋白提取率可高达66%，相对于传统方法提高了20%，并且获得的板栗蛋白中蛋白含量可高达88%，纯度高，质量好，并且由于提取条件温和，能够很好地保持板栗蛋白的活性。

另外，根据本发明上述实施例的制备板栗蛋白质的方法还可以具有如下附加的技术特征：

需要说明的是，适用于本发明的原料包括鲜板栗、干燥过的板栗、板栗粉。本发明的方法中所采用的主要萃取剂为去离子水。原料的品种、品质以及蛋白的含量，对终产品的品质与得率将产生一定的影响，但均比采用现有技术制备板栗蛋白质的效率高，品质好。

根据本发明的实施例，于400w超声功率下，进行超声波细胞破碎处理6-14min，优选10min。由此，能够使细胞结构松动，加强后续纤维素酶的作用效果。根据本发明的实施例，所述板栗粉水溶液的料液比为1g：15ml。换句话说，所述板栗粉水溶液是通过将板栗粉和水按照1g：15ml的比例混合配制获得的。由此，有利于后续蛋白的溶出和提取。此外，需要说明的是，前述的板栗粉可以通过以下方法制备获得：选用无霉变虫蛀的新鲜板栗为原料，经过去皮、切片、冷冻干燥后经粉碎机粉碎，过60目筛制成板栗粉。

根据本发明的实施例，于40-60摄氏度优选50摄氏度，pH4-6优选pH4.5条件下进行所述第一酶解处理5-15min，优选10min。由此，能够有效促进板栗蛋白溶出，且能够保持蛋白活性。根据本发明的另一些实施例，进行所述第一酶解处理时，所述纤维素酶与所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液的比例为50-150U/g，优选100U/g。由此，能够有效破坏细胞壁促进蛋白溶出，有利于后续的蛋白提取。

根据本发明的实施例，于30-50摄氏度优选40摄氏度，pH5.5-6.5优选pH6.1条件下进行所述第二酶解处理25-35min，优选30min。由此，能够使板栗淀粉有效酶解，进而能够有效解除淀粉对蛋白质的包络，从而有利于蛋白溶出。根据本发明的另一些实施例，进行所述第二酶解处理时，所述第一α-淀粉酶与所述第一酶解产物的比例为80-160U/g，优选120U/g。由此，能够有效提高板栗淀粉的酶解效率，去除淀粉对蛋白质的包络，且能够保持蛋白质的活性。

根据本发明的一些优选示例，于40摄氏度下，按照120U/g的比例利用第一α-淀粉酶进行所述第二酶解处理30min。由此，淀粉酶解效率高，对蛋白质的包络少，且能够保持蛋白质的结构和活性。

根据本发明的实施例，所述碱提处理包括：将所述第二酶解处理产物进行pH调节至pH为8.0-10.0优选10.0，并于30-50摄氏度优选40摄氏度下进行所述碱提25-35min，优选30min。由此，能够提高蛋白的溶出率，获得富含蛋白质的碱提产物。根据本发明的一些具体示例，将所述第二酶解处理产物进行pH调节至pH10.0，并于40摄氏度下进行所述碱提30min。由此，能够使蛋白高效溶出。

根据本发明的实施例，可以将经过第一离心后获得的滤渣加去离子水洗涤、超声破碎后再离心，然后收集上清液合并入所述蛋白质碱提液，以便提高板栗蛋白的提取率。

需要说明的是，发明人发现，蛋白质碱提液中淀粉含量仍然较高，因而，本发明的方法在蛋白质碱提液中加入淀粉酶水解其中的淀粉，以便蛋白的分离。根据本发明的实施例，于30-50摄氏度优选40摄氏度，pH5.5-6.5优选pH6.1条件下进行所述第三酶解处理25-35min，优选30min。由此，能够有效打破淀粉对蛋白的包络作用，方便后续酸沉的进行。根据本发明的实施例，进行所述第三酶解处理时，所述第二α-淀粉酶与所述蛋白质碱提液的比例为80-160U/g，优选120U/g。由此，板栗淀粉溶解效率高，对包络板栗蛋白质的淀粉去除效果好，且不会破坏蛋白质的活性。

根据本发明的实施例，所述酸沉是在等电点pH4.2条件下进行的。由此，能够使板栗蛋白质有效沉淀。

根据本发明的实施例，该制备板栗蛋白质的方法进一步包括将所述板栗蛋白进行真空冷冻干燥。由此，能够有效获得板栗蛋白粗提取物。具体地，根据本发明的一些实施例，利用真空冷冻干燥机进行所述真空冷冻干燥。由此，能够有效实现真空冷冻干燥，获得板栗蛋白粗提取物。

根据本发明的一些具体示例，本发明的制备板栗蛋白质的方法还可以包括以下步骤：将板栗粉与水按1:15（g/mL）比例溶解获得板栗粉水溶液，然后将其于超声波功率400w下进行超声波破碎处理10min。接着，按100U/g的比例向经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液中加入纤维素酶，调pH到4.5，放入50℃恒温水浴搅拌酶解10min。然后调pH=6.1，加入低温α-淀粉酶，酶添加量为120U/g，并于40℃下继续保温搅拌酶解30min，接着，用1mol/mLNaOH调pH到10.0后，放入40℃水浴锅中浸提30min，然后，离心取上清液，调上清液的pH至6.1后，按120U/g的酶添加量加入低温α-淀粉酶，并于40℃下继续保温搅拌酶解30min后，在等电点pH4.2条件下进行酸沉，离心取沉淀，水洗沉淀至中性后即得板栗蛋白质，然后将其真空冷冻干燥保存。

需要说明的是，相对于传统方法，本发明的制备板栗蛋白质的方法着重考虑在提高板栗蛋白提取率的同时保护板栗蛋白的结构不被破坏，通过α-淀粉酶、纤维素酶和超声波细胞破碎仪的作用，促进板栗蛋白的溶出，减少了板栗淀粉的残留，并且由于提取条件温和，能够有效保持蛋白质的活性，从而有利于生物活性和功能性蛋白质的后续研究及工业化生产。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的制备板栗蛋白质的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一般方法：

参照图1，根据本发明的实施例，本发明的制备板栗蛋白质的方法一般包括以下步骤：

首先，将板栗粉水溶液进行超声波破碎处理，以便获得经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液。

其次，利用纤维素酶对所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液进行第一酶解处理，以便获得第一酶解产物。

再次，利用第一α-淀粉酶将所述第一酶解产物进行第二酶解处理，以便获得第二酶解产物。

接着，将所述第二酶解处理产物进行碱提处理，以便获得碱提产物。

接下来，将所述碱提产物进行第一离心，并收集上清液，以便获得蛋白质碱提液。

然后，利用第二α-淀粉酶将所述蛋白质碱提液进行第三酶解处理，以便获得第三酶解产物。

接着，利用等电点沉淀法将所述第三酶解产物进行酸沉，以便获得酸沉产物。

接下来，将所述酸沉产物依次进行静置和第二离心，以便收集获得沉淀。

然后，将所述沉淀进行水洗至中性，以便获得所述板栗蛋白质。

实施例1

根据前面所述的一般方法，参照图1，按照以下步骤制备板栗蛋白质：

选用无霉变虫蛀的新鲜板栗为原料，经过去皮、切片、冷冻干燥后经粉碎机粉碎，过60目筛制成板栗粉。然后，将板栗粉与去离子水按照1:15（g/mL）的比例溶解获得板栗粉水溶液并置于超声破碎仪（JAV-IV型超声波细胞粉碎仪，济宁市奥波超声波电器有限公司）中，在400w超声功率下，处理10min。然后按照100U/g的比例向经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液中加入纤维素酶（西格玛奥德里奇公司，货号22178），再调pH至4.5，转入50℃恒温水浴锅（W201B型恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司）搅拌酶解10min。接着，调pH=6.1，加入α-淀粉酶（西格玛奥德里奇公司，货号A1031），酶添加量为120U/g，于40℃下保温搅拌酶解30min。然后，用1mol/mLNaOH调pH到10.0，并放入40℃水浴锅（W201B型恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司）中浸提30min后，离心取上清液，再调上清液pH至6.1，然后按照120U/g的酶添加量加入α-淀粉酶（西格玛奥德里奇公司，货号A1031），并于40℃下继续保温搅拌酶解30min后，在等电点pH4.2条件下进行酸沉，然后离心取沉淀，水洗沉淀至中性即得板栗蛋白质，再将其真空冷冻干燥（ThermoFisherLL1500冻干机，美国赛默飞世尔科技有限公司）保存。

经计算，板栗蛋白质提取率为66%，且因为提取条件温和，制得的板栗蛋白活性非常好。另外，通过凯氏定氮法（KDY-9830凯氏定氮仪，北京市通润源机电技术有限责任公司）测得板栗粗蛋白的蛋白含量为88.43%。

对比例1

选用无霉变虫蛀的新鲜板栗为原料，经过去皮、切片、冷冻干燥后经粉碎机粉碎，过60目筛制成板栗粉。然后，利用传统碱水法，按照以下流程所示的步骤提取制备板栗蛋白质：

脱脂板栗粉末→按料水比1:15(g/mL)加入蒸馏水调pH到9.0→在45℃水浴下浸提140min→离心（4000r/min，10min）→取上清液→酸沉（用1mol/LHCl调pH到4.2）→收集沉淀。

所述沉淀即为板栗蛋白，经计算，板栗蛋白提取率为39.69%。

对比例2

选用无霉变虫蛀的新鲜板栗为原料，经过去皮、切片、冷冻干燥后经粉碎机粉碎，过60目筛制成板栗粉。然后，利用亚临界水提取法，按照以下流程所示的步骤提取制备板栗蛋白质：

脱脂板栗粉末→按料水比1:15(g/mL)加入蒸馏水调pH到9.0→亚临界水萃取（提取温度180℃、提取时间25min和提取压力4.0MPa条件下）→冷却→离心（4000r/min，10min）→取上清液→酸沉（用1mol/LHCl调pH到4.2）→收集沉淀。

所述沉淀即为板栗蛋白，经计算，板栗蛋白提取率为45.28%。

对比实施例1、对比例1和对比例2可知，本发明的制备板栗蛋白质的方法的板栗蛋白质提取率，相对于传统碱水法提高了26%，相对于亚临界水提取法提高了21%。表明相对于传统方法，本发明的制备板栗蛋白质的方法的板栗蛋白质提取率显著提高。此外，由实施例1可知，本发明的制备板栗蛋白质的方法获得的板栗蛋白纯度高，活性好，蛋白含量可高达88%。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (17)

1.一种制备板栗蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将板栗粉水溶液进行超声波破碎处理，于400W超声功率下，进行所述超声波破碎处理6-14min，以便获得经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液；

利用纤维素酶对所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液进行第一酶解处理，于40-60摄氏度，pH4-6条件下进行所述第一酶解处理5-15min，以便获得第一酶解产物；

利用第一α-淀粉酶将所述第一酶解产物进行第二酶解处理，于30-50摄氏度，pH5.5-6.5条件下进行所述第二酶解处理25-35min，以便获得第二酶解产物；

将所述第二酶解处理产物进行碱提处理，以便获得碱提产物；

将所述碱提产物进行第一离心，并收集上清液，以便获得蛋白质碱提液；

利用第二α-淀粉酶将所述蛋白质碱提液进行第三酶解处理，于30-50摄氏度，pH5.5-6.5条件下进行所述第三酶解处理25-35min，以便获得第三酶解产物；

利用等电点沉淀法将所述第三酶解产物进行酸沉，以便获得酸沉产物；

将所述酸沉产物依次进行静置和第二离心，以便收集获得沉淀；以及

将所述沉淀进行水洗至中性，以便获得所述板栗蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于400W超声功率下，进行所述超声波破碎处理10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于50摄氏度，pH4.5条件下进行所述第一酶解处理10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述第一酶解处理时，所述纤维素酶与所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液的比例为50-150U/g。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行所述第一酶解处理时，所述纤维素酶与所述经过超声波破碎处理的板栗粉水溶液的比例为100U/g。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于40摄氏度，pH6.1条件下进行所述第二酶解处理30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述第二酶解处理时，所述第一α-淀粉酶与所述第一酶解产物的比例为80-160U/g。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进行所述第二酶解处理时，所述第一α-淀粉酶与所述第一酶解产物的比例为120U/g。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱提处理包括：

将所述第二酶解处理产物进行pH调节至pH为8.0-10.0，并于30-50摄氏度下进行所述碱提25-35min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述碱提处理包括：

将所述第二酶解处理产物进行pH调节至pH为10.0，并于40摄氏度下进行所述碱提30min。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于40摄氏度，pH6.1条件下进行所述第三酶解处理30min。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述第三酶解处理时，所述第二α-淀粉酶与所述蛋白质碱提液的比例为80-160U/g。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，进行所述第三酶解处理时，所述第二α-淀粉酶与所述蛋白质碱提液的比例为120U/g。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸沉是在等电点pH4.2条件下进行的。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述板栗蛋白进行真空冷冻干燥。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，利用真空冷冻干燥机进行所述真空冷冻干燥。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述板栗粉水溶液的料液比为1g：15ml。